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老司机养成记——Western Blot技巧大放送一招轻松搞定低信号,高背景!

楼主:生物咖啡茶 时间:2018-04-05 10:29:21

本文摘自默克生命科学


Western Blot是目前最常用的蛋白检测方法,几乎所有实验室都需要用到这个技术,大家都会被信号太弱,背景过高等看似非常小的问题折磨过!然后师兄,师姐,论坛,网站,各种求助,但结果却往往收效甚微。宝贵的青春,满满的自信就这样被实验一点点摧残,“苍天啊,大地啊”能不能赐我一本Western Blot通关秘籍!


实验固然很残酷,不过今天和大家介绍一个小技巧,对于信号太弱,背景过高,无需任何优化,你只需一瓶神奇的药水“signal boost”即能轻松搞定Western Blot!

真实场景1:


二师兄,你一师兄,我的WB蛋白含量低,得到的信号太弱了,肿么办”(如左边A图结果);直对着手机傻乐什么呢?


你这样的结果汇报给老板,肯定会被老板教训的,你要是发文章,肯定也是会被拒的


但是我的目标蛋白含量就是很少啊,我已经想了很多办法优化,加大上样量,提高一抗,二抗浓度,但是效果都不明显,这个问题已经困扰我很长时间了


这个问题看似很小,但是优化起来非常麻烦,少则一两周,多则几个月,不过你可以使用SignalBoost免疫信号增强剂试试!

(如右边B图结果为添加了Signal Boost后,能显著增强信号,检测到低丰度蛋白)

让我们来一起见证奇迹的实验过程:

样品:K562细胞全细胞裂解液。
(Lane 1: 25μg总蛋白;Lane 2: 5μg总蛋白;Lane 3: 2.5μg总蛋白)

一抗:anti-PKC(Ab-2)小鼠单抗(MC5)(货号OP74),分别用5%脱脂奶粉PBST溶液(图A)和SignalBoost Solution 1(图B)按照1:1000比例稀释
二抗:Rabbit anti-mouse IgG,分别用5%脱脂奶粉PBST溶液(图A)和Solution 2(图B)按照1:10,000比例稀释。
检测:化学发光法(曝光30秒)


真实场景2:


师兄,为什么你能跑出一条很漂亮的条带,我跑的条带这么丑不说,还有这么多的杂带(如下左图结果)


你这种非特异性条带过多的情况,如果汇报给老板,不光被骂,还会被嫌弃的,如果发文章的话,肯定也是不行的


那你说我该怎么优化呢,我看了很多网站和论坛,大家说了很多的原因,包括样本不干净,样本有讲解,抗体不特异,二抗不纯,封闭液不干净等等,我都蒙了,到底我该怎么优化呢


其实你上面说的都是传统的优化方法,但是需要结合很多条件进行摸索,可能也需要一两周甚至更长的时间!不过你可以试试更快捷,效率更高的SignalBoost,它可以有效降低背景和非特异性杂带

(如下右图是仅仅添加了SignalBoost,便可显著降低非特异条带,降低背景)


奇迹的产生往往如此简单:


样品:全细胞裂解液

一抗:anti-ERK1的抗体,分别用5%脱脂奶粉PBST溶液(左图)和Solution 1(右图)按照1:200比例稀释
二抗:分别用5%脱脂奶粉PBST溶液(左图)和Solution 2(右图)按照1:3000比例稀释,室温1小时

检测:化学发光法(曝光5分钟)


真实场景3:


师兄,为什么你们的WB做出来的结果这么干净啊,为什么我的结果很脏,背景太高了,导致信号太低,都看不到我的特异性条带”(如下图上部分的结果)


这种结果可千万不要给老板看,也不要说是我教过你,这种结果会被老板嫌弃的


此处大家往往“一脸懵x”样,拿你说怎么优化啊,我在网站和论坛上求助,大家很热情,但是提的建议太多,有人说缓冲液使用次数太多,有人说封闭液不干净,有人说二抗需要过滤,到底该怎么优化啊?


这种结果你也可以使用Signal Boost试试(下图下部分结果加了SignalBoost后能大大提高信噪比,使目的条带完美呈现)


奇迹的产生也是如此简单:


一抗:anti-p-PRAK,分别用5%脱脂奶粉PBST溶液(上图)和Solution 1(下图)按照1:1000比例稀释。

二抗:用5%脱脂奶粉PBST溶液(上图)和Solution 2(下图)按照1:2000比例稀释。


真实场景4:


师兄,为什么导师这么喜欢你,器重你啊,有没有啥秘密武器传授一下


因为我不光会做实验,能解决各种实验问题,我还能帮老板,实验室省钱呢


神马?都做一样的实验,一样的试剂和耗材,怎么会省钱?


比如WB实验来说,相同的实验流程,使用SignalBoost可以使信号更强,但是只需1/5甚至1/10的抗体用量就可以达到以前一样的效果啊(如下图1结果为在细胞样本中使用1/5抗体用量即可取得高特异性结果)



一抗:anti-p-P38,用5%脱脂奶粉PBST溶液(上图)按照1:1000比例稀释;用Solution 1(下图)按照1:5000比例稀释。

二抗:用5%脱脂奶粉PBST溶液(上图)和Solution 2(下图)按照1:4000稀释)

如下图2为在组织样本中使用1/10抗体用量即可取得高特异性结果。

样品:大鼠脑组织裂解液。

一抗:anti-SERT兔多抗,用2.5%脱脂奶粉PBST溶液(图A)按照1:1000比例稀释;用Solution 1(图B)按照1:10,000比例稀释。
二抗:anti-rabbit IgG,用2.5%脱脂奶粉PBST溶液(图A)按照1:1000比例稀释;用Solution 2(图B)按照1:10,000比例稀释。




师兄,原来都是套路啊!那么signal boost到底是什么呢?

以下为Signal Boost新技术介绍:

Signal Boost是德国默克公司经验丰富的研发团队经过不断摸索,开发的免疫信号增强试剂盒(货号:407207)。是一种用于免疫检测的特殊配方的抗体稀释液,可以促进抗原抗体特异性结合,产生比传统方法高几倍甚至十几倍的信号强度,从而解决免疫检测实验中(比如免疫印迹,ELISA等)经常遇到的低灵敏度和高背景强度等问题,得到准确清晰的实验结果。


试剂盒操作简单方便,含有溶液1和2两种即用型溶液,分别用做一抗和二抗的稀释液,替代其他的传统稀释缓冲液,如TBS,TBST,PBS,PBST等。其余操作均按照标准的免疫检测操作流程进行。此外,试剂盒中各组分对标记抗体的酶活性(辣根过氧化物酶HRP,碱性磷酸酶AP等)均没有影响,可以用于化学发光,比色法,荧光法检测实验。

SignalBoost 免疫信号增强试剂盒有几大优势:


1

显著改善信噪比,提高低丰度蛋白的检测成功率,得到更好的结果;


2

与传统的方法相比,最多可节省90%的抗体用量,大大节约了实验成本;


3

使用方便,操作简单。即用型溶液,不需任何前处理,节省时间和精力;


4

应用面广。可用于WB、ELISA、免疫斑点杂交等检测实验

与化学发光,比色法,荧光法兼容。

当然,我们也提供中文说明书,欢迎索取咨询

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也可和当地代理商联系!


更重要的是

如果选择Signal Boost,可以免费给大家送一本Western Blot通关秘籍(蛋白印迹技术手册)含基本原理,经验技巧,常用工具,操作详解和疑难解答!


部分SignalBoost™ 免疫信号增强剂应用文献和简单操作示意图

1. Sones W.R., et al., (2010), Cholesterol Depletion Alters Amplitude and Pharmacology of Vascular Calcium-activated Chloride Channels, Cardiovasc Res., 87(3), 476-84.

2. Kadota Y., et al., (2009) Involvement of Mesoderm-speci_c Transcript in Cell Growth of 3T3-L1 Preadipocytes, Journal of Health Science, 55(5), 814-19.

3. Lo S.Z., et al., Tumor Necrosis factor-αPromotes Survival in Methotrexate-exposed Macrophages by an NF-κB-dependent pathway, Arthritis Res Ther., 13(1), R24


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