CRISPR/Cas基因编辑技术最新研究进展
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CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，其以消灭外来的质体或者噬菌体并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”。
CRISPR/Cas系统全名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。目前已发现三种不同类型的 CRISPR/Cas系统，存在于大约40%和90%已测序的细菌和古菌中。其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白>以及向导RNA(gRNA)为核心的组成。由于其对DNA干扰(DNAi)的特性，目前被积极地应用于遗传工程中，作为基因体剪辑工具，与锌指核酸酶(ZFN)及类转录活化因子核酸酶(TALEN)同样利用非同源性末端接合(NHEJ)的机制，于基因体中产生去氧核糖核酸的双股断裂以利剪辑。二型CRISPR/Cas并经由遗传工程的改造应用于哺乳类细胞及斑马鱼的基因体剪辑。其设计简单以及操作容易的特性为最大的优点，未来将可应用在各种不同的模式生物当中。
我们今天称为CRISPR的基因组重复丛集，即原核生物拟核DNA链中的丛生重复序列，在1987关于E. coli的一份研究报告中被首次描述。2000年，相似的重复序列在其它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列（Short Regularly Spaced Repeats，SRSR）。2002年SRSR被重命名为CRISPR。其中一部分基因编码的蛋白为核酸酶和解旋酶，这些关联蛋白（CAS， CRISPR-associated proteins）与CRISPR组成了CRISPR/CAS系统。
由于CRISPR/Cas技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台，受到众多科学家的追捧。CRISPR-Cas技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。因此本文中小编对CRISPR/Cas的最新研究进展进行了汇总盘点。
作为基因编辑技术CRISPR/Cas9的领跑者，Intellia Therapeutics近日宣布与诺华展开一项长达5年的研发合作计划，主要致力于加速发展CRISPR/Cas9技术在CAR-T细胞治疗和造血干细胞中的应用。此次合作仅仅在Intellia与Atlas Venture和Caribou Biosciences合作3个月之后，再次证明了Intellia的团队和研发能力。
以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。CRISPR/Cas9在多种类型的细胞和组织中都具有高效精确的基因编辑能力，在CAR-T、造血干细胞等体外治疗手段中是一个非常理想的操作平台，在体内也可适用。
根据合作协议，诺华将享有此次合作研发项目中CAR-T的专利权，而诺华会和Intellia共同推进关于造血干细胞治疗的多个项目，并且双方同意共同分配研发和所有权，这将会使Intellia独立发展造血干细胞生产管线内部的所有权。
麻省理工的科学家们对目前最热门的基因编辑系统CRISPR/Cas9进行了改造，这一成果发表在十二月十日的Nature杂志上。现在，人们可以用这一技术在活细胞中有效启动任何基因。
这个系统可以让科学家们更简便地研究不同基因的功能，领导这项研究的CRISPR技术先驱张锋（Feng Zhang）说。
改造后的CRISPR技术，可以快速对整个基因组进行功能筛选，帮助人们鉴定涉及特定疾病的基因。张锋等人在这项研究中就鉴定了让黑色素瘤细胞抵抗癌症药物的几个基因。
查尔斯·狄更斯在《双城记》中如是说，这是最好的时代，也是最坏的时代。这句名言用到今天的生命科学中显得最为合适不过。
不同于过去几十年，生物医药产业如今收到了来自各方面的关注和金融投资者前所未有的重视。许多生物学家不必再像以前那样为了自己的研究穷尽一生，却最终都未能看到他们的成果转化为实际产品，为世人造福。如今，当许多科学家的成果尚停留在实验室阶段时，就已经引起了生物医药产业巨头的关注，并为后续的进一步开发做好准备。
然而，成果转化的加速并不光是科学家名利双收，还为这些科学工作者带来不小的烦恼。
由MIT几位教授成立的生物医药公司Editas Medicine最近就遇到了类似的烦恼。公司几位科学家此前开发出一种CRISPR-Cas9的疗法，这种方法能够通过DNA剪切技术治疗多种疾病。这一成果理所当然的受到了众多投资公司和生物医药巨头的关注。公司成立伊始，就获得了包括Polaris， Third Rock等风投公司的投资。这距离研究人员在该领域取得突破过去了仅仅不到两年的时间。
上个月在美国硅谷，科学家Jennifer Doudna 和Emmanuelle Charpentier身穿黑色礼服获得了奖金为300万美元的生命科学突破奖。她们因开发出强大且应用范围极广的基因组编辑工具CRISPR-Cas9获奖，CRISPR被誉为本世纪目前为止生物技术领域的最大突破。
笔者上个月也对该新闻进行了报道，当时心中也有疑问，为什么为人熟知的CRISPR/Cas9技术的先驱，MIT-Harvard Broad研究所的张锋没有获奖。读者中也有很多人产生同样的疑问。
今年4月15日， Broad研究所成功申请了CRISPR-Cas9技术的专利，张锋博士就是该专利的发明者，这使得他和他的研究所几乎可以控制所有与CRISPR相关的重要商业使用。
那么问题来了！为什么CRISPR的专利和科学突破奖落在了不同的人手中？
4日，博德研究所授予GE医疗和Sigma生物CRISPR/Cas9相关知识产权用于研究应用。
据此，GE医疗和Sigma生物将获得博德研究所的CRISPR/Cas9专利组合，其中包括由博德研究所的Feng Zhang开创的利用病人真核细胞进行基因编辑的技术。
此外，博德许可GE医疗发展其最新开创的Dharmacon Edit-R CRISPR/Cas9基因编辑系统用于建立永久的可遗传的基因敲除细胞模型（gene knockouts cells）。而Sigma生物将在产权许可范围内创建可私人定制的慢病毒CRISPR克隆。同时，Sigma也是博德Mission shRNA and ORF libraries文库的独家经销商。授权交易的具体条款没有被披露。
经典的基因组编辑技术，即编辑已知的DNA序列，通过增加、删除基因来实现基因功能的激活或者抑制；该技术可应用于医学、生物技术、食品及农业等领域。近日，刊登在国际杂志Molecular Cell上的一篇研究论文中，来自北卡罗来纳大学的研究人员检测了6种关键的分子元件，其或许可以帮助开发新型的基因组的编辑系统，即CRISPR-Cas系统。
Rodolphe Barrangou教授表示，利用CRISPR-Cas系统可以对细菌和人类细胞中的特殊DNA序列进行作用，CRISPR表示成簇的规律间隔的短回文重复序列，而Cas是一种和CRISPR系统相关联的蛋白质、基因家族，其可以以序列依赖性的方式对DNA进行切割和靶向作用。
细菌可以利用CRISPR-Cas系统作为抵御外来入侵者的防御机制和免疫机制，这项研究中研究者揭示了CRISPR-Cas系统工作的机制和原理，倘若我们把这个系统比作一个谜语，那么本文就对该谜语进行了解答；CRISPR-Cas系统让全球很多寻找新技术控制基因的科学家非常着迷，这项研究可以帮助科学家们增强靶向DNA的特异性和有效性，为进行更多的遗传修饰提供基础工作。
规律成簇的间隔短回文重复CRISPR与内切酶Cas9的组合，原本是细菌抵御病毒的重要武器，现在这一组合已经成为了一个通用工具，被用于在真核生物中进行位点特异性的基因组编辑。
由于这种基因组编辑技术更易于操作，也具有更强的扩展性，CRISPRs-Cas9迅速成为了科研领域的新宠儿。
日前，麻省理工的张锋（Feng Zhang）博士领导研究团队向人们展示了CRISPR-Cas9的新应用。他们用这一技术在哺乳动物大脑中进行了基因功能的活体研究，文章发表在十月十九日的Nature Biotechnology上。
张锋博士是CRISPR/Cas9技术的先驱之一。他是麻省理工学院脑与认知科学助理教授、McGovern 脑研究所和Broad研究所核心成员。去年七月，张锋荣获了美国生物医学大奖：瓦利基金青年研究家奖（Vallee Foundation Young Investigator Award），奖金25万美元。其研究组研究方向为设计新的分子工具来操控活体大脑。
日前，来自加州大学旧金山分校的科学家在《细胞》（Cell）杂志上报告称，他们应用一种新型的、精确的方法开启和关闭了细胞内的基因。这一成果有可能促成更好地了解疾病以及开发出新的治疗方法。
这一研究进展的核心是一个叫做SunTag的新发明。SunTag实质上是一套分子挂钩，其能够将多个拷贝的生物活性分子挂到可用来靶向一些基因或其他的分子的蛋白质支架上。相比于没有这些挂钩的组装分子，整合了SunTag的分子生物活性显着放大。
开发这一SunTag的是加州大学旧金山分校分子和细胞药理学教授、霍华德休斯医学研究所（HHMI）研究员Ron Vale博士实验室的研究人员。Vale曾因发现了在细胞内运送货物的分子马达而获得2012年的Albert Lasker基础医学研究奖。
Vale研究小组利用SunTag显着放大了研究人员通常利用来标记细胞内分子的绿色荧光蛋白的发光信号。通过显微镜观察，可以看到借助SunTag获得的信号非常之强，以至于可以利用它来追踪Vale研究的分子马达中的单个分子。
厦门大学的袁晶教授参加了此次大会并发表了题为"Efficient Editing of Malaria Parasite Genome Using the CRIPR/Cas9 System"的精彩报告。
疟疾是由疟原虫属寄生虫感染引起的传染性疾病，全球每年约有数亿人口感染疟疾，其中上百人死亡。基于目前疟原虫对抗疟药产生抗药性，袁晶教授致力于寻找新的抗疟靶点。袁晶教授在报告中讲到，疟原虫作为一种没有siRNA干扰系统和非同源末端连接修复机制的生物，极大地限制了人类对疟原虫基因功能的揭示。他们对于疟原虫基因组的编辑做了很多尝试，这些尝试都为疟原虫基因组编辑工作的成功积累了宝贵的意见。
之后袁晶教授重点讲述了他们使用CRISPR/Cas9系统将DNA双链断裂引入到疟原虫基因组中的各个技术关键点，他们通过同源重组的修复机制，实现了疟原虫基因组中的多个基因的不同类型修饰，包括基因删除、基因加标签和等位基因替换。他们的工作极大地促进了疟原虫生物学的研究。
温州医科大学附属眼视光医院的谷峰教授参加了此次大会并发表了题为"PAM序列对CRISPR/Cas9介导的基因组编辑的影响及AAV-CRISPR/Cas9对人类胚胎干细胞的基因组编辑"的精彩报告。
谷教授基于GFP报告系统，通过定性和定量的方法，系统的研究了PAM序列对CRISPR/Cas9介导的基因组编辑的影响。他们除了验证了之前张峰教授发表在《自然生物技术》上的NGG的效率高于NAG之外，还系统的比较了NGA这种PAM结构与其他两种PAM结构对基因组编辑效率的影响。结果显示，这三种PAM结构均有介导Cas9切割基因组的能力，并且其介导切割效率依次为：NGG>NGA>NAG.
另外，谷峰教授还讲述了他们利用AAV-CRISPR/Cas9对人类胚胎干细胞的基因组进行的定点编辑的相关工作，他们将RFP基因成功插入到视网膜光感受器特意表达的基因NRL位点，这种基因敲除的的胚胎干细胞对干细胞介导的人类视网膜疾病的治疗具有重要意义。
作为近两年大热的CRISPR技术先锋人物之一，张锋（Feng Zhang）博士成为了科学界冉冉升起的一颗最闪亮的新星。近日，The Scientist以“Feng Zhang： The Midas of Methods”为题，向我们介绍了这位出生于80后，年仅32岁的华人科学家。当张锋还在爱荷华州之时，在放学之后的每周日这位年轻人都要在人类基因治疗研究所的一个实验室中度过5个小时。张锋牢记着他的导师提出的一些“疯狂的想法”，例如绿色荧光蛋白（GFP）能够吸收紫外光，因此可以作为防晒霜。而当他纯化出GFP，将它厚厚地涂在一层DNA之上时，他发现事实上GFP确实能够防止DNA损伤。
张锋的研究项目赢得了许多科学竞赛大奖的第一名，这些奖金在后来帮助了他支付在哈佛大学的学费。尽管在分子生物学上取得了很大的成功，但张锋却选择了主修化学和物理学。张锋说：“我希望能够在变化不太迅速的一些科学领域中打下坚实的基础。物理和化学的一些法则相当固定。而每一天分子生物学都在不断地变化。”
他的本科学位最初阻碍了他在2004年成为斯坦福大学的研究生。张锋想从事大脑研究，但由于他未接受过正规的神经科学培训，他咨询过的所有教授都拒绝了他。最终，Karl Deisseroth接受了张锋，让他到自己的实验室中去转转，他们的合作生成了神经科学领域最具变革性的一项技术。“他的技能对于光遗传学（optogenetics）的产生绝对至关重要，”Deisseroth说。
基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等。目前，基因组编辑有三大技术：CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN。与传统的TALEN和ZFN技术相比，CRISPR/Cas9系统更便捷、高效，应用也更广泛，目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。
CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRISPR-associated），被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。
structure of the RNA-guided immune surveillance Cascade complex in Escherichia coli”的研究进展，。本文揭示了关于CRISPR系统中Cascade的晶体结构及其与RNA相互作用的方式。
成簇的、有规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaeed short palindromic repeats，CRISPR）和它的辅助蛋白（CRISPR-associated， Cas）构成CRISPR/Cas系统，以一种类似于真核生物RNA干扰(RNAi)的作用机制，在原核生物抵抗入侵的噬菌体和质粒的防御系统中发挥着重要作用。CRISPR-Cas系统分为三个类型（I型，II型和III型），大肠杆菌CRISPR/Cas 系统属于I-E型，由5种Cas蛋白组成的11个亚基（其中含有1个CasA，2个CasB，6个CasC，1个CasD和1个CasE）以及一段61个核苷酸的成熟crRNA（CRISPR RNA）组成Cascade（CRISPR-associated complex for antiviral defense）复合物。Cascade复合物的质量约为405kDa，外观上呈现出近似于“海马”的结构，王艳丽研究组通过深入研究，获得了分辨率为3.05 埃的X射线晶体结构。
目前，弗吉尼亚大学医学院的研究人员在《自然-生物技术》杂志上报告称，他们设计出了一种方法来检测风靡科学界的CRISPR/Cas9基因编辑系统，竟发现了其中意想不到的副作用。
称为CRISPR的基因打靶系统，可让我们编辑基因组中特定靶位点的遗传信息。这种新方法揭示的系统，有可能会结合意想不到的位点，导致其中一些位点发生基因突变，这些突变可能对药物疗法的研究与开发，产生严重的后果。
然而，这种新方法也可以确定一些途径，帮助阻止那些潜在危险的"脱靶"影响，让科学家们可以改进这种重要的新基因编辑系统所得到的结果。
弗吉尼亚大学生物化学和分子遗传学系的MazharAdli解释说，基因操作的一个主要目标是纠正有害突变，所以避免突变的意外引入，是至关重要的。
众所周知，CRISPR（全称clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即“成簇的规律性间隔的短回文重复序列”）是广泛分布于细菌和古菌中的一种获得性免疫系统。该系统首先从外源病毒（或质粒）中获取特定DNA片段并作为间隔序列（spacer）存储在其CRISPR中，此过程称为“适应”；然后利用相应spacer产生的crRNA识别和降解携带同源序列的外源质粒或病毒，此过程称为“干扰”。显而易见，适应过程获得的spacer决定了干扰机器的靶分子。然而多年来，CRISPR如何在适应过程中区分异己的外源DNA和自身的染色体DNA一直困扰着科学家们。有意思的是，在大多数实验室构建的单一病毒侵染细菌的模型中，CRISPR适应过程很难发生，这严重地阻碍了该领域的研究，因此CRISPR适应过程也是CRISPR研究领域中目前相对最不清楚的过程。最近，中国科学院微生物研究所向华研究员带领的极端嗜盐古菌研究团队在这一领域取得重要发现，近期连续两篇相关论文发表在国际知名期刊Nucleic Acids Research上。
根据英国《每日邮报》报道，科学家首次利用基因组编辑技术治愈成年老鼠活体所患的遗传性肝脏疾病。由此我们可以看到此项技术的应用前景，该技术用于治疗人类肝病的时代将指日可待了。
这项名为Crispr的技术可对庞大的脱氧核糖核酸(DNA)数据库作出科学家所称的高精度微调。
科学家使用Crispr技术修正了老鼠遗传字母表中的一个“字母”，这个发生突变的“字母”位于一个与肝脏代谢有关的基因中。
新技术的基本原理
科学家声称，人类遗传性肝病是人体内同一种基因的类似突变所致，而这项新技术对于基因的控制显现得更为精确。新技术使用“切割酶”修改人的23对染色体的特定目标片段，不会引发意外突变或缺陷。
这种酶是1987年被发现的，起初被斥为“垃圾DNA”。后来科学家才确定，它是细菌用以抵挡病毒入侵的防御物。但直到两年前，人们才充分认识到这种酶的潜能。科学家发现，它可与一种名叫Cas9的能瞄准DNA的酶化合，可用于编辑人类基因组。
位于瑞士巴塞尔的生物技术公司通过融资2500万美元资金以开发基于Cas9技术的基因剪切技术CRISPR-Cas9。这项技术可以被用于治疗基因类疾病。这也是目前药物研发中的一大热点。Versant Ventures是此次投资方。公司CEO Rodger Novak表示公司计划在未来两年内将员工数目增加至20人到25人。
CRISPR公司是目前第二家主攻这一技术的生物技术公司，尽管这家公司刚刚成立，但其拥有雄厚的学术基础。诺贝尔奖获得者Craig Mello等专家都为这家公司提供技术协助。CRISPR-Cas9技术可以定向剪切靶向基因，因而被认为可以用于治疗基因突变疾病。
另一方面，CRISPR公司的成立也标志着目前生物医药产业的新趋势，那就是来自全球不同国家的机构联合起来进行同一课题的开发。
如果只是一份报告发表的话，仅会获得一些关注。但是当有6份报告同时发表时，这便意味着它是大势所趋。
细菌也会生病，这对于乳品业来说是一个潜在的大问题。乳品业通常依靠细菌（诸如嗜热链球菌）生产酸奶和乳酪。嗜热链球菌将牛奶中的乳糖分解为有刺激性的乳酸。但是某些病毒，诸如噬菌体能逐步削弱细菌，进而对在细菌作用下生产的食物的质量或数量造成严重损害。
CRISPR技术
2007年，来自丹尼斯克公司（一家总部位于丹麦哥本哈根的食品添加剂公司，目前被杜邦公司收购）的科学家找到了一种能增强细菌防御噬菌体能力的方法。这一发现使得杜邦公司能够为食品生产培育更强壮的菌株。一些基本的原理也被揭示：细菌具备一种有高度适应性的免疫系统，使得它们能击退来自某种噬菌体的多次进攻。
突然之间，不仅是食品科学家和微生物学家，很多领域都意识到细菌免疫系统的重要性，因为它具备一个非常有价值的特性：以某个特定的基因序列为目标。今年1月，4个研究团队报告了这一被称为CRISPR的系统。在接下来的8个月中，许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因，从而证明了这个技术的广泛适用性。
国际著名生物学期刊《Nature Biotechnology》（2012年影响因子为32.44）于8月8日在线正式发表了上海市调控生物学重点实验室、华东师范大学生科院生命医学研究所刘明耀教授和李大力副教授课题组的最新研究成果。这是继今年6月该课题组在《Nucleic Acids Research》杂志发表基因敲除小鼠新技术后，再次在国际著名生物期刊上报道课题组在基因敲除大鼠和小鼠技术上所获得突破和成果。
基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但传统的基因敲除方法需要通过打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、技术要求很高，而且费用大、耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。刘明耀、李大力课题组一直致力于开发基因敲除动物新技术。其团队于今年6月在《Nucleic Acids Research》发表了关于转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）的技术论文，成为世界上最早利用该技术构建基因敲除小鼠的两个团队之一。
CRISPR-Cas源自细菌和古细菌的免疫系统，可利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该课题组将该技术运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。研究发现：RNA注射的方式将CRISPR-Cas系统导入小鼠受精卵比DNA注射能更有效的在胚胎中产生定点突变；该方法无小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组DNA进行删除；同时注射针对不同基因的RNA序列能够在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变。此外，课题组利用CRISPR-Cas技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关G蛋白偶联受体Mc4R）突变大鼠具有一致的表型。
成簇的规律间隔性短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences， CRISPR)是细菌用来抵抗病毒的一种基因系统.在一项新的研究中，来自美国埃默里大学的研究人员发现CRISPR参与协助一些细菌躲避哺乳动物免疫系统.相关研究结果于2013年4月14日在线发表在Nature期刊上，论文标题为"A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence".
细菌利用CRISPR进行自我保护.它的功能最初是由乳制品行业研究人员试图阻止噬菌体(感染细菌的病毒)毁坏用来制造奶酪和酸奶的细菌培养物的过程中发现的.细菌将来自噬菌体的小片段DNA整入到它们自身的CRISPR区域，并且通过摄入噬菌体的DNA所获得信息来阻止这些病毒的入侵.
如今，在这项新的研究中，研究人员证实与一种导致兔热病的细菌和另一种导致脑膜炎的细菌亲缘关系较近的新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida， 简称F. novicida)需要CRISPR系统的一部分来维持传染性.在哺乳动物细胞内生长的细菌F. novicida利用CRISPR系统的一部分关闭一种细菌基因从而逃避它们的宿主利用这种基因触发的检测和破坏.
然而，CRISPR-Cas技术尤其是CRISPR-Cas9作为基因编辑的核心技术，它仍然是一项非常新颖的技术，除了存在“脱靶”的主要问题外，还有许多的技术难点尚未突破，尤其是临床应用的有效性和安全性依然是科学家关注和争论的焦点。
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