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丁酸梭菌的研究应用进展

蛋鸡健康养殖推广平台2018-05-22 12:40:31


丁酸梭菌的研究应用进展

张善亭 史燕 张淑丽 王海宽

摘要:丁酸梭菌是从健康人和动物肠道中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌,因其能够产生芽孢的益生功能被广泛的研究。丁酸梭菌作为新一代芽孢益生菌制剂,较非芽胞益生菌制剂具有耐热、耐酸和耐多种抗生素等生物学特性,能对宿主产生各种健康作用。如调节肠道微生态平衡、稳定胃肠道功能、产生益生物质、提高机体免疫及促进动物生长等,具有更好的应用发展前景。主要对丁酸梭菌的生物学功能、发酵工艺及其在临床与动物饲料中的应用研究进展进行综述,并展望丁酸梭菌今后的研究方向。
关键词:丁酸梭菌 益生菌 发酵工艺 临床 动物饲料
丁酸梭菌(Clostridium butyricum),又名宫入菌、酪酸梭菌,细菌学分类属于梭菌属(Clostridium),是一种厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌,培养后期细菌的革兰氏染色呈阴性。丁酸梭菌是人和动物肠道的正常菌群,也广泛的存在于土壤、奶酪和天然酸奶中。菌体呈直杆状或稍有弯曲,单个或成对,灰白色,细菌直径为(0.5-1.7)×(2.4-7.6)μm,两端钝圆,周身鞭毛,具运动性;芽孢偏心或次端生(内生),呈圆形或椭圆形,无孢外壁和附属丝。在琼脂平板上形成白色或奶油色的不规则圆形菌落,稍突,表面湿润光滑,不透明,略有酸臭味[1,2]。
丁酸梭菌具有抵抗外界相对恶劣环境的理化性质。经80、30 min 和90、10 min 热处理不会失活,最适生长温度为36,最高和最低起始生长温度为44和16 ;pH 1.0 时仍能存活,其最适起始生长pH 为7.2,最高和最低起始生长pH 为10.6 和4.6 ;最适起始氧化还原电位为-21 mV[3]。在体内丁酸梭菌能耐受胃液、胆汁酸和消化液的作用,在室温下具良好的储存性与稳定性;丁酸梭菌只对新生霉素、万古霉素和四环素等少数抗生素敏感,对其他多种抗生素具有很强的耐药性,具有良好的应用前景。
1.丁酸梭菌及其代谢产物的功能研究进展
1.1 调节肠道微生态平衡
丁酸梭菌具有防止病原菌及腐败菌在肠道内的异常增殖和促进肠道有益菌群增殖、发育的双重作用,从而纠正肠道菌群紊乱,减少肠毒素的产生。丁酸梭菌对艰难梭菌具生物拮抗作用,初步证实是通过细胞紧密接触抑制毒性蛋白的表达,其抑制机理仍待深入研究。两种菌在体外共培养时,艰难梭菌的毒性大幅度降低甚至消失,主要是因为丁酸梭菌芽孢萌发与扩增的速率是艰难梭菌的两倍,产生的短链脂肪酸更有效的抑制艰难梭菌芽孢的萌发及其生长[4]。陈秋红等[5]研究表明丁酸梭菌具有较强的耐高温、耐酸和耐胆盐的生物学特性,对肠道致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌具较强的抑制作用,同时显著促进肠道有益菌的生长,丁酸梭菌发酵提取物分别使试验组嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和粪链球菌的活菌数比对照组提高了100%、93.3% 和81.3%(P<0.05)。
1.2 增强免疫功能,促进动物的生长
在临床应用中,用热灭活的丁酸梭菌制成的疫苗具有激活巨噬细胞和NK 细胞的作用,口服丁酸梭菌显著增加了血清中IgA 和IgM 含量[2]。利用丁酸梭菌发酵动物饲料能降低饲料中的抗营养因子,提高氨基酸、维生素、有机酸和有机磷等营养物质,改善适口性、摄入量和利用率;添加到动物饲料具有替代抗生素预防和治疗相关动物疾病的潜力,抑制内源性疾病的发生,且增强机体免疫和血液中白细胞(CD4+)的数量,以及改善动物的生产性能和产品质量,减少抗生物用量,提高经济效率[6]。张彩云等[7]在断奶仔猪的日粮中添加1‰的丁酸梭菌,显著提高了仔猪的平均日增重,添加3‰的丁酸梭菌能显著提高仔猪饲料的转化效率,添加3‰和5‰的丁酸梭菌,其免疫机能、抗病力均明显提高,其中添加5‰丁酸梭菌组的血清乳酸脱氢酶的活性显著低于抗生素对照组,IgG 水平、C3 水平显著高于抗生素对照组。在鮸鱼饲料中添加一定量的丁酸梭菌[8],其血清酚氧化酶活力、酸性磷酸酶活力显著高于对照组(P<0.05),血清与体表黏液中的溶菌酶活性、IgM 水平以及其生长均显著增高,故丁酸梭菌能调节鮸鱼的体液免疫应答和改善其生长性能。
1.3 产生益生物质
丁酸梭菌的主要代谢产物是丁酸(表1),而丁酸是结肠上皮细胞的能量代谢和正常生长主要的营养物质[9],能量供应的不充分是导致结肠炎的主要因素之一,而结肠上皮细胞70% 能量一般是从丁酸盐中获得,葡聚糖硫酸酯能抑制丁酸氧化而对葡萄糖代谢没有影响,通过对老鼠口服葡聚糖硫酸酯便引发结肠炎[10]。存在于肠上皮细胞的TOLL-样受体能识别诸多细菌及细菌产物并被其激活,丁酸梭菌激活的是TOLL-样受体2(TLR2)调节的骨髓分化因子88(MyD88)的非依赖性途径,即TLR2 接受刺激后导致适量NF-κB、IL-8、IL-6 及TNF-α 的分泌,以抵抗病原菌的感染且防止了自身免疫紊乱,而非依赖于MyD88 激活NF-κB,进而导致IL-8、IL-6 及TNF-α 的过度分泌[11]。丁酸具有抗炎症效应,体现在能改变肠道pH 而抑制部分NF-κB 转移因子的活力,自然降低炎症细胞因子(IL-8、IL-6)的过度表达[12]。丁酸盐还具有促进癌细胞凋亡和在体外抑制癌细胞的增殖,从而在体内发挥抵抗癌症的积极作用[13,14]。从丁酸梭菌中抽提并纯化的脂磷壁酸,能抑制拜氏梭菌和大肠杆菌对人结肠癌细胞以及肠道细胞的黏附[15],从其芽孢中分离的脂质部分能一定程度的抑制白血病淋巴细胞、胸腺癌和肺癌细胞中尿激酶的合成[16]。Arimochi 等[17]利用丁酸梭菌发酵大豆蛋白,发酵液中存在着诱导细胞凋亡的物质且能在体外诱导HCT116 结肠癌细胞的死亡,从而得出肠道菌能够利用食物源性蛋白产生抗肿瘤物质的结论。
丁酸梭菌还产生乙酸和丙酸等短链脂肪酸,培养基中添加1% 的抗性淀粉时,丁酸梭菌产生的乙酸、丙酸、丁酸的摩尔比为1.811[18]。在胃肠道中,短链脂肪酸在产生部位直接被吸收,同时刺激肠道蠕动,改善肠道微环境,调节微生态平衡,治疗相关疾病。丁酸梭菌产生的氨基酸、B 族维生素和维生素K,能促进VE 的吸收,补充必要的营养物质;分泌淀粉酶、糖苷酶以及降解饲料的果胶酶、葡聚糖酶,产生促双歧杆菌发育的因子,同有益菌群共生,对机体产生各种保健功能。丁酸梭菌还能分解胺类、吲哚类、硫化氢等有害物质,减少癌症的发生率和改善粪便的恶臭,从而提高健康质量和改善环境。
      

此外,在临床应用方面,丁酸梭菌制剂或与其他益生菌、中药提取物和抗生素联合使用,能有效的治疗腹泻、肠炎、肠易激综合症和新生儿黄疸、手足口病等诸多疾病,且疗效显著。在再生能源开发方面,因丁酸梭菌可发酵碳水化合物产氢气而备受关注。Plangklang 等[19]利用甘蔗渣做支撑材料固定丁酸梭菌,使发酵甘蔗汁产氢气的速率提高了20%,最佳优化条件下每消耗1mol己糖便产生1.52mol氢气。丁酸梭菌还是生产1,3-丙二醇很好的发酵菌,产生的1,3-丙二醇被良好的用于生产轻化工产品。
2.酸梭菌发酵工艺研究进展
在丁酸梭菌的液态培养方面,戚薇等[20]采用单因素和正交试验优化得到最佳培养基组成为(g/L):胰蛋白胨10,葡萄糖8,酵母膏4。于37培养24 h,活菌数可达4.1×108 CFU/mL,培养基中添加K2HPO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L、CaCO3 1 g/L,培养32 h,活菌数芽孢转化率可达95%,也简化了培养基成分。其中,最经济的工业发酵培养基被确定[21]为每升培养液中含有8 g 葡萄糖、20 g 豆粕(中性蛋白酶水解3 h)和5 g 啤酒酵母粉,最适培养条件下培养48h,丁酸梭菌活菌数可达8×108 CFU/mL,使成本降低了90%。至于固态发酵技术的应用,王海宽等[22]在丁酸梭菌固态发酵方面已经获得了授权专利,丁酸梭菌活菌数大于1.0×109 CFU/g。
此外,Hakalehto 等[23]发现CO2 是梭状芽孢杆菌生长的一个必要的信号,在丁酸梭菌的纯培养过程中,外部环境中没有CO2 将导致其生长的大量延迟或难以启动;丁酸梭菌与短乳杆菌存在着共生关系,同时短乳杆菌产生的CO2 能够更好地启动丁酸梭菌的生长。亦有学者利用丁酸梭菌跟鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌混合培养来制备丁酸梭菌复合制剂,并将其作为医药和饲料添加剂应用于人类和养殖动物。
3.动物饲料中应用
食物传染疾病的爆发强调了减少动物器官食物中病原菌的必要性,动物肠内病原菌是食物污染的直接来源,世界对抗生素抗性基因能够从动物转移到人类的广泛关注,导致欧盟决定自2006 年1 月1日禁止使用抗生素作为生长促进剂[34]。丁酸梭菌制剂成为替代抗生素的一种理想选择,既能减少抗生素的使用所引起的抗药性、二重感染等,又能提高动物的自然防御机制和经济效益。我国农业部已于2009 年7 月批注了丁酸梭菌制剂作为微生物饲料添加剂的使用。
3.1 作为动物益生菌制剂
在韩国,丁酸梭菌制剂已经被用于牛、猪和家禽的饲料添加剂。国内诸多研究证实丁酸梭菌发酵能够使饲料酸化软化,提高营养物质和适口性;在动物体内以绝对优势抢占空间生态位和营养生态位,产生多种益生物质,提高饲料利用率;保持动物肠道内微生物菌群正常化,产生丁酸梭菌素,抑制肠道有害菌,提高动物抗病力、免疫力,减少死淘率以及降低粪便中NH3、H2S 的含量,但目前丁酸梭菌制剂还未被普遍的作为益生菌剂添加于动物饲料。孙梅等[35]最新研究成果是采用微胶囊化包埋丁酸梭菌,以提高丁酸梭菌作为饲料添加剂的使用效果。经研究确定丁酸梭菌在采用4% 的海藻酸钠和2% 的明胶混合物作为壁材的包埋剂中活菌数能增殖至4.9×109 CFU/mL, 包埋率达99.5%。微胶囊颗粒具备良好的稳定性、耐热性、肠溶性,耐酸性及耐胆盐性试验前后活菌数量差异不显著(P>0.05),但耐胃酸及耐胆盐较未包埋的对照组有显著提高。最终为微胶囊化丁酸梭菌作为饲料添加剂的实际应用奠定一定的理论基础。
3.2 改善动物的生产性能
丁酸梭菌制剂能减少动物饲料中抗生素、类激素类物质的使用,改善动物的生产性能,提高禽畜肉蛋奶制品产量和鱼类的受精率、产卵量、孵化率及鱼苗成活率。家禽肠道绒毛的长度与其肠上皮细胞数量呈显著正相关。当绒毛变长时,肠上皮细胞数增多,对营养物质的消化吸收能力增高。在1 日龄AA 肉鸡中添加0.9% 丁酸梭菌能显著提高肠道绒毛长度,从而也能显著提高肉鸡平均日增重量,且试验组的发病率和死淘率均显著低于对照组[36]。在肉鸡的饲料中添加适量的丁酸梭菌,盲肠消化物的pH 和盲肠的相对长度降低显著,空肠黏膜上的碱性磷酸酶活性以及盲肠中的短链脂肪酸相对增加,暗示食用油和丁酸梭菌相互作用对肉鸡肠道产生了健康的影响[37]。
丁酸梭菌制剂可以显著提高种鸭蛋的受精率。机理是丁酸梭菌在肠道内可产生多种维生素和酶等物质,有助于促使种番鸭对钙、磷、锰、锌、铜和铁等的吸收,满足种番鸭繁殖性能的需要,提高种公鸭的精液品质及种蛋的受精率,又避免了使用抗生素而产生的种种弊端[38]。
3.3改善动物产品质量
丁酸梭菌制剂能调节动物肠道微生态平衡以及治疗相关动物疾病,有效地减少二重感染和动物体内的药物残留;增加血中蛋白氮的含量,改善蛋白质的代谢,能降低血清中的胆固醇水平;产生各种益生物质,利于补充必需的营养,维持机体正常生理功能,促进代谢,改善畜禽渔产品质量,进而保证畜禽渔产品的质量符合生产、加工、销售及出口的标准,以冲破国际贸易上的“绿色壁垒”。
当肉鸡的饲料中添加一定剂量的丁酸梭菌时,肉鸡腹部脂肪中的脂蛋白脂肪酶活力、空肠黏膜中肝型脂肪酸结合蛋白基因的表达、胸肌中的十二碳五烯酸和n-3 不饱和脂肪酸的含量均增加显著(P<0.05),同时肌肉的剪切力明显降低,而对于胸肌中的滴水损失,饮食中的油脂(鱼油)和丁酸梭菌存在着极显著(P<0.01)的交互作用,有力地证明丁酸梭菌能够改善肉制品的质量和提高胸部肌肉中必要的不饱和脂肪酸含量[39,40]。
4.展望
丁酸梭菌制剂作为新一代的芽孢益生菌剂,具备良好的生理、生化特性,较非芽孢益生菌剂耐储存、活菌数稳定,且能与抗生素联合使用。但丁酸梭菌的发酵需严格的厌氧条件,对培养基成分及设备要求较高,故低成本的发酵工艺仍待深入研究。随着丁酸梭菌与其他益生菌共生关系的建立,利用固态混菌发酵技术生产丁酸梭菌制剂具有培养基简单且来源广泛、投资少、能耗低、污染环境较少等优点,较液态纯培养具诸多优势,这将使丁酸梭菌益生菌制剂的大规模制备成为可能。
在动物饲料中的应用方面,为确保经济效益、产品的质量和减少抗生素的使用,应进一步提高丁酸梭菌在胃肠道内的活性研究和加强其在饲料加工过程中对多种外加条件的承受能力,在此基础之上研究生产高效稳定的丁酸梭菌制剂及生产工艺;在饲料制备过程中,应关注与其他菌的共生发酵,以提高饲料的适口性、营养、转化率和降低成本,同时,需研究丁酸梭菌与其他药物的协同作用,目的在于有效治疗动物疾病、降低死亡率。再者,当针对不同的动物和不同的生长阶段,添加不同剂量的丁酸梭菌制剂,以保证在畜牧业、禽业、渔业等方面发挥其最大的作用。
在临床应用方面,丁酸梭菌及其代谢产物具有重要的生理功能,对人和动物的健康产生各种影响且效果显著,然而其中诸多有利于健康的影响并非决定性的,丁酸梭菌及其代谢产物的作用机制、益生原理有待于深入研究,尤其是在维持微生态平衡、治疗炎症和癌症方面,为丁酸梭菌制剂的应用提供必要的理论依据。另一方面,不同的益生菌各有其功效,丁酸梭菌对多种抗生素具有很强的耐药性,其与其他益生菌、益生素在体外或体内的协同作用有待于发现。此外,丁酸梭菌的其他功效以及与新技术的结合更有待于研究。

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