老司机养成记-Western Blot技巧大放送:招轻松搞定低信号,高背景!
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Western Blot是目前最常用的蛋白检测方法，几乎所有实验室都需要用到这个技术，大家都会被信号太弱，背景过高等看似非常小的问题折磨过！然后师兄，师姐，论坛，网站，各种求助，但结果却往往收效甚微。宝贵的青春，满满的自信就这样被实验一点点摧残，“苍天啊，大地啊”能不能赐我一本Western Blot通关秘籍！
实验固然很残酷，不过今天和大家介绍一个小技巧，对于信号太弱，背景过高，无需任何优化，你只需一瓶神奇的药水“signal boost”即能轻松搞定Western Blot！
真实场景1：
二师兄，你一师兄，我的WB蛋白含量低，得到的信号太弱了，肿么办”（如左边A图结果）；直对着手机傻乐什么呢？
你这样的结果汇报给老板，肯定会被老板教训的，你要是发文章，肯定也是会被拒的
但是我的目标蛋白含量就是很少啊，我已经想了很多办法优化，加大上样量，提高一抗，二抗浓度，但是效果都不明显，这个问题已经困扰我很长时间了
这个问题看似很小，但是优化起来非常麻烦，少则一两周，多则几个月，不过你可以使用SignalBoost免疫信号增强剂试试！
（如右边B图结果为添加了Signal Boost后，能显著增强信号，检测到低丰度蛋白）
让我们来一起见证奇迹的实验过程：
样品：K562细胞全细胞裂解液。
（Lane 1: 25μg总蛋白；Lane 2: 5μg总蛋白；Lane 3: 2.5μg总蛋白）
一抗：anti-PKC（Ab－2）小鼠单抗（MC5）（货号OP74），分别用5%脱脂奶粉PBST溶液（图A）和SignalBoost Solution 1（图B）按照1：1000比例稀释
二抗：Rabbit anti-mouse IgG，分别用5%脱脂奶粉PBST溶液（图A）和Solution 2（图B）按照1：10,000比例稀释。
检测：化学发光法（曝光30秒）
真实场景2：
师兄，为什么你能跑出一条很漂亮的条带，我跑的条带这么丑不说，还有这么多的杂带（如下左图结果）
你这种非特异性条带过多的情况，如果汇报给老板，不光被骂，还会被嫌弃的，如果发文章的话，肯定也是不行的
那你说我该怎么优化呢，我看了很多网站和论坛，大家说了很多的原因，包括样本不干净，样本有讲解，抗体不特异，二抗不纯，封闭液不干净等等，我都蒙了，到底我该怎么优化呢
其实你上面说的都是传统的优化方法，但是需要结合很多条件进行摸索，可能也需要一两周甚至更长的时间！不过你可以试试更快捷，效率更高的SignalBoost，它可以有效降低背景和非特异性杂带
(如下右图是仅仅添加了SignalBoost，便可显著降低非特异条带，降低背景)
奇迹的产生往往如此简单：
样品：全细胞裂解液
一抗：anti-ERK1的抗体，分别用5%脱脂奶粉PBST溶液（左图）和Solution 1（右图）按照1：200比例稀释
二抗：分别用5%脱脂奶粉PBST溶液（左图）和Solution 2（右图）按照1：3000比例稀释，室温1小时
检测：化学发光法（曝光5分钟）
真实场景3：
师兄，为什么你们的WB做出来的结果这么干净啊，为什么我的结果很脏，背景太高了，导致信号太低，都看不到我的特异性条带”（如下图上部分的结果）
这种结果可千万不要给老板看，也不要说是我教过你，这种结果会被老板嫌弃的
此处大家往往“一脸懵x”样，拿你说怎么优化啊，我在网站和论坛上求助，大家很热情，但是提的建议太多，有人说缓冲液使用次数太多，有人说封闭液不干净，有人说二抗需要过滤，到底该怎么优化啊?
这种结果你也可以使用Signal Boost试试(下图下部分结果加了SignalBoost后能大大提高信噪比，使目的条带完美呈现)
奇迹的产生也是如此简单：
一抗：anti-p-PRAK，分别用5%脱脂奶粉PBST溶液（上图）和Solution 1（下图）按照1：1000比例稀释。
二抗：用5%脱脂奶粉PBST溶液（上图）和Solution 2（下图）按照1：2000比例稀释。
真实场景4：
师兄，为什么导师这么喜欢你，器重你啊，有没有啥秘密武器传授一下
因为我不光会做实验，能解决各种实验问题，我还能帮老板，实验室省钱呢
神马？都做一样的实验，一样的试剂和耗材，怎么会省钱？
比如WB实验来说，相同的实验流程，使用SignalBoost可以使信号更强，但是只需1/5甚至1/10的抗体用量就可以达到以前一样的效果啊(如下图1结果为在细胞样本中使用1/5抗体用量即可取得高特异性结果)
一抗：anti-p-P38，用5%脱脂奶粉PBST溶液（上图）按照1：1000比例稀释；用Solution 1（下图）按照1：5000比例稀释。
二抗：用5%脱脂奶粉PBST溶液（上图）和Solution 2（下图）按照1：4000稀释）
如下图2为在组织样本中使用1/10抗体用量即可取得高特异性结果。
样品：大鼠脑组织裂解液。
一抗：anti-SERT兔多抗，用2.5%脱脂奶粉PBST溶液（图A）按照1：1000比例稀释；用Solution 1（图B）按照1：10,000比例稀释。
二抗：anti-rabbit IgG，用2.5%脱脂奶粉PBST溶液（图A）按照1：1000比例稀释；用Solution 2（图B）按照1：10,000比例稀释。
师兄，原来都是套路啊！那么signal boost到底是什么呢？
以下为Signal Boost新技术介绍：
Signal Boost是德国默克公司经验丰富的研发团队经过不断摸索，开发的免疫信号增强试剂盒（货号：407207）。是一种用于免疫检测的特殊配方的抗体稀释液，可以促进抗原抗体特异性结合，产生比传统方法高几倍甚至十几倍的信号强度，从而解决免疫检测实验中（比如免疫印迹，ELISA等）经常遇到的低灵敏度和高背景强度等问题，得到准确清晰的实验结果。
试剂盒操作简单方便，含有溶液1和2两种即用型溶液，分别用做一抗和二抗的稀释液，替代其他的传统稀释缓冲液，如TBS，TBST，PBS，PBST等。其余操作均按照标准的免疫检测操作流程进行。此外，试剂盒中各组分对标记抗体的酶活性（辣根过氧化物酶HRP，碱性磷酸酶AP等）均没有影响，可以用于化学发光，比色法，荧光法检测实验。
SignalBoost 免疫信号增强试剂盒有几大优势：
显著改善信噪比，提高低丰度蛋白的检测成功率，得到更好的结果；
2
与传统的方法相比，最多可节省90%的抗体用量，大大节约了实验成本；
3
使用方便，操作简单。即用型溶液，不需任何前处理，节省时间和精力；
4
应用面广。可用于WB、ELISA、免疫斑点杂交等检测实验，与化学发光，比色法，荧光法兼容。
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