【基础·易路科研】常用的细胞凋亡检测方法

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的 DNA 特异性染料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种染料与 DNA 的结合都是非嵌入式的，主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成 1 mg/ml 的浓度，使用时用 PBS 稀释，终浓度为 10 μg/ml。DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成 1 mg/ml 的浓度，使用终浓度一般为 10 μg/ml。

结果评判 

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ 期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

透射电子显微镜观察

结果评判 

凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

Annexin V 法

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图 3）。Annexin-V 是一种分子量为 35～36 KD 的 Ca2+  依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。将 Annexin-V 进行荧光素（FITC、PE）或 biotin 标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5～1×106）用 PBS 洗 2 次，加入 100 μl Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，室温避光 30 min，再加入 PI（50 μg/ml）5 μl，避光反应 5 min 后，加入 400 μl Binding Buffer，立即用 FACScan 进行流式细胞术定量检测（一般不超过 1 h）， 同时以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为阴性对照。贴壁培养的细胞染色：先用 0.25% 的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

DNA Ladder 测定

收获细胞（1×107）沉淀→细胞裂解液→13 000 rpm ×5 min→收集上清，加 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，孵育 2 h→蛋白酶 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 体积 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍体积的冷无水乙醇沉淀 DNA，4 °C 过夜→14 000 rpm×15 min→最后将沉淀溶解在 TE buffer 中，加 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖凝胶电泳，EB 染色并照相。

Western blot

收集细胞→PBS 洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE 电泳→硝酸纤维素膜或 PVDF 膜转移→5% 脱脂奶粉封闭，室温 1.5～2 h 或 4 °C 过夜→Caspase-3 多抗或单抗室温反应 1～2 h 或 4 °C 过夜→TBS-T（含 0.05% Tween 20 的 TBS）洗 3 次，5～10 min/ 次→HRP- 标记的羊抗鼠 IgG 或 AP 标记的羊抗鼠 IgG 室温反应 1～2 h→ TBS-T 洗 3 次， 5～10 min/ 次→ECL 显影或 NBT/BCIP 显色。