WB你是不是转膜出问题了?

今天，我们来说说WB实验！

看看大家常遇到的问题，也帮大家总结分析一下~

目的条带什么都没有

一抗和二抗不匹配

二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）

没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白

1、降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后不调）

2、使用效价高的一抗

3、延长抗体孵育时间，一抗4℃过夜，二抗室温1-2h

4、在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一起，导致孵育不充分

5、一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导致孵育不充分

封闭液与一抗或二抗有交叉反应

1、选择合适的封闭液（例如磷酸化抗体选择 BSA溶液进行封闭）

2、选择合适的一抗，二抗的稀释液（建议选择 成分比较清楚的BSA或者明胶）

抗原量不足

1、检测样本中目的蛋白表达较少

2、每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照

3、磷酸化抗体检测优先使用BSA进行封闭

4、使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高

组织中目的蛋白含量低

1、选择特异表达目的蛋白的组织

2、组织新鲜，及时提取，尽快使用

3、使用相应的蛋白酶抑制剂

显色液失活

检测使用的显色液是不是有效，特别是ECL显色中，ECL-B特别容易失效

激发光波长选择不合适

1、对于不同荧光标记的二抗，选择合适的激发光波长

显色方式的选择：1、ECL显色比DAB显色灵敏度高5-10倍；2.ECL发光液分普通，灵敏，超敏，在信号上 有明显的差异； 3.延长曝光和显色时间。

高背景

膜没完全均匀湿透

使用100% methano浸透膜

阻断不充分

增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂

未进行非特异性封闭或封闭不充分

1、延长封闭条件（一般室温1h）

2、考虑更换合适的封闭剂（例如使用5%脱脂奶粉）

3、封闭的时候几张膜在一起，导致封闭不充分

4、提高封闭液中，脱脂奶粉或者BSA的浓度

抗体与阻断蛋白有交叉反应

检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中Tween-20可减少交叉反应

出现许多黑点和斑

1、不要封闭时才匆忙配奶粉，要确保奶粉完全溶解，否则不溶颗粒附着在膜上，溶解后静止，轻吸上层牛奶层封闭，封闭结束后，进行三次彻底的洗膜

2、封闭剂中有聚集体 使用前过滤封闭试剂 

3、HRP耦联二抗中有聚集体 过滤二抗试剂，去除聚集体

条带拖尾

蛋白量太大，一抗浓度和时间太长

调整蛋白量，同时一抗浓度缩小和孵育时间缩短

有阳性条带，但其比较弱

样品和抗体问题

1、选择样本是否有目的的蛋白高丰度表达

2、增加上样量

3、降低抗体的稀释比例

4、磷酸化的抗体选择BSA的封闭液

5、样本中加入相应的蛋白酶抑制剂

6、显色体系问题（ECL-B液效果降低）

没有阳性条带

1、抗体染色不充分 增加抗体浓度，延长孵育时间 

2、酶失活，直接将酶和底物进行混合，如果不显色则，说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 

3、标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低原因

4、试剂不匹配 一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配

5、一抗失效 选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液 HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

条带中出现规则白圈

转膜出现气泡

放膜时候，使膜U型放，两边下压；盖海绵前确定气泡除尽，盖后放置动作要小幅轻微，防止产生不必要的气泡

好了，今天的介绍就暂时到此，明天大家也记得来看啊~

编辑：咸鱼君

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