顺铂联合小分子柑橘果胶对肺癌细胞增殖与凋亡的影响

【摘要】 目的 探讨顺铂联合小分子柑橘果胶( MCP) 对人肺癌细胞的增殖及凋亡通路的影响方法采用四甲基偶氮唑盐法检测各浓度顺铂单药( 单药组) 、 顺铂联合 LCP( 联合组) 对人肺癌细胞 A549 增殖的影响，用流式细胞仪检测半抑制浓度顺铂单药及联合用药处理 A549 细胞的凋亡比例， 采用 Western blot 分析凋亡相关蛋白procaspase- 3 8 9 的变化 结果 顺铂单药与联合MCP 用药对A549 细胞生长均有抑制作用， 其效应呈时间和浓度依赖性;联合组对A549 细胞的生长抑制作用更为显著( P ＜0． 01) 。单药与联合用药均能使A549 细胞凋亡比例增加， 联合组较单药组细胞凋亡更加显著 单药组与联合组 A549 细胞的凋亡相关蛋白 procaspase- 3 8 9蛋白的表达均下调， 联合组较单药组procaspase- 3 9 蛋白表达下调更为显著， 但两组procaspase- 8 蛋白表达无明显差异结论 MCP 能增加顺铂的细胞增殖抑制和诱导凋亡能力， 该效应可能与活化线粒体凋亡途径有关。

关键词 肺癌; 顺铂; 小分子柑橘果胶; 细胞增殖; 细胞凋亡

顺铂是治疗肺癌的主要药物之一， 主要通过DNA 损伤和 p 53 介导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。由于顺铂在化疗中耐药性影响了治疗效果， 限制其在临床的应用， 其耐药机制可能与半乳糖凝集素- 3( galectin- 3， Gal- 3) 有关，Gal- 3 与肿瘤形成，发展与转移的全过程密切相关小分子柑橘果胶( Modified citrus pectin， MCP) 能够有效封闭阻断 Gal- 3 功能，本实验旨在探讨 MCP 与顺铂联合对肺癌细胞株 A549 增殖抑制的效应。

1 材料与方法

1． 1 仪器与试剂 SynergyTM Mx 多功能酶标仪( 美国 BioTek 公司) ; FACSCalibur 流式细胞仪( 美国 BD公司) ; 二氧化碳培养箱( 英国 Thermo Labsystems 公司) ; 水浴箱( W6M- 2B 型 SL SHELDON 公司) ; 5810型离心机( 德国 Eppendof 公司) ; TS100 倒置生物显微( 日本 Nikon 公司) ; TE2000S 显微照相仪( 日本Nikon公司) ; 电泳仪( 美国 Bio- Rad 公司) ; 蛋白质的转膜仪( 美国 Amersham Biosciences 公司) ; 凝胶成像系统( 美国 Kodak 公司) ; 96 孔和 6 孔板( 美国Coming 公司)顺铂( 齐鲁制药有限公司) ; 小分子柑橘果胶( 美国圣特莱公司) ; RPMI- 1640 培养液新生小牛血清 0． 25%胰蛋白酶( 美国 Gibco 公司) ; 四甲基偶氮唑盐( MTT， 上海华舜生物工程有限公司) ; 二甲基亚砜(DMSO， 美国 Sigma 公司) ; Annexin V- EGFP /P细胞凋亡检测试剂盒 细胞周期检测试剂盒( 南京凯基生物有限公司) ; procaspase- 3 9 兔多克隆抗体procaspase- 8 鼠单克隆抗体 PARP 兔单克隆抗体， 抗兔二抗( 美国 CST 公司) 人肺癌细胞株A549 由广州医学院肿瘤研究所提供。

1． 2 实验方法

1． 2． 1 细胞培养: 人肺癌 A549 细胞为贴壁细胞， 将细胞置于10%新生小牛血清和青霉素 链霉素双抗的 RPMI- 1640 培养液中， 青霉素浓度为100 U/ml， 链霉素为 100 g /ml 37℃ 5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养， 1 ～ 2 d 换液1 次， 取指数生长期的细胞用于实验 细胞单层贴壁生长， 待长至 80% ～ 90% 细胞发生融合时， 用含 0． 25%的胰酶和 0． 02%乙二胺四乙酸的消化液消化细胞传代培养， 收集对数生长期细胞用于实验。

1． 2． 2 MTT 实验检测细胞增殖情况: 收集对数生长期的细胞， 制备成1 ×105/ml 的细胞悬液， 每孔100 l 接种于96 孔培养板， 边缘孔用无菌磷酸盐缓冲液( PBS)填充 37℃ 5% CO2 条件下培养24 h， 进行实验分组，加入不同浓度的药物 100 l， 每孔终体积为 200 l各组药物浓度为: ( 1) 单药组: 顺铂1 2 4 8 16 g /L;( 2) 联合组:上述浓度顺铂分别+5 mg /ml 小分子柑橘果胶; ( 3) 空白对照组:加入100 l 培养基 各药物浓度设18 个复孔 培养72 h， 在对照孔细胞达90%融合后， 在各孔加入5 mg /ml 的 MTT 试剂20 l， 在培养箱内继续孵育4 h， 弃上清液， 加入DMSO 150 l， 室温下震荡溶解10 ～ 15 min， 待紫色结晶完全溶解后， 用酶标仪测定570 nm波长吸光度值重复3 次 细胞抑制率( %) =( 1 －实验组平均OD值/对照组平均OD值) ×100%。

1． 2． 3 细胞凋亡率检测: 采用流式细胞仪分析， 收集半抑制浓度顺铂 顺铂联合的小分子柑橘果胶干预6 h 24 h 48 h 后的 A549 细胞，PBS 洗2次， 用适量结合缓冲液重新悬浮细胞， 使其浓度为1 ×106/ml 加100 l 的细胞悬液( 约为1 × 105)入5 ml 流式管中， 每管加入 5 l Annexin V/FITC 和5 l 20 g /ml 的碘化丙啶， 避光混匀， 标记 15 min对照不加 Annexin V 作校正因子 在反应管中加入400 l PBS， 进行流式细胞检测。

1． 2． 4 Western blot 检测凋亡相关蛋白表达: 取对数生长期的 A549 细胞， 常规消化成 5 × 103/ml 的单细胞悬液， 接种于 6 孔细胞培养板 IC50 浓度的顺铂单药 IC50 浓度的顺铂联合 5 mg /ml 小分子柑橘果胶分别处理24 h 48 h， 用预冷的 PBS 洗涤细胞3 次，加入裂解液裂解， 冰上作用20 min， 4℃ 12 000 r /min离心10 min 上清液保存于 － 20℃ 采用 Bradford法测定蛋白浓度 电泳 转膜 5%脱脂奶粉中 37℃封闭90 min， 加一抗( procaspase- 3 8 9 PARP) ， 4℃孵育过夜， 洗膜缓冲液漂洗后， 加入二抗， 37℃摇床混合1 h， 洗膜缓冲液充分漂洗， 洗膜后加入增强化学发光底物， 检测杂交信号， 显影 定影， 凝胶图像分析。

1． 3 统计学分析 应用 SPSS 13． 0 统计软件处理数据 计量资料用x ± s 表示， 两组间的比较采用两独立样本 t 检验， 多组间均数比较采用单因素方差分析， 等级资料采用秩和检验， 重复测量资料比较采用重复测量资料的方差分析 以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2． 1 DDP单药及联合 MCP 用药对 A549 细胞增殖的影响药物作用72 h 后， DDP 对肺癌细胞A549 有明显的增殖抑制作用， 并呈现剂量依赖性( r = 0． 51， P ＜ 0． 05) ，DDP对A549细胞的IC50 浓度为( 11． 53 ±0． 11) mmol /L

而联合组72 h 后， 各个浓度的联合用药组细胞生长抑制率均显著高于 DDP 单药组( P ＜ 0． 05) ， 表明两药物具有协同作用单药组和联合组细胞生长均受到明显抑制， 抑制作用随时间延长而增强， 呈现时间依赖性( P ＜ 0． 05)。

表 1  DDP 单药与联合用药后 A549 细胞生长抑制率的比较( % )

时点

组别

顺铂浓度( mg /L)

IC50 值

1

2

4

8

16

24 h

单药组

4． 2 ± 2． 4

7． 2 ± 2． 3

10． 4 ± 2． 2

32． 4 ± 2． 5

48． 6 ± 2． 4

17． 96 ± 0． 60

联合组

4． 6 ± 2． 3

7． 6 ± 2． 1

10． 8 ± 2． 3

33． 5 ± 2． 1

49． 1 ± 2． 5

17． 66 ± 0． 73

48 h

单药组

10． 7 ± 2． 1

28． 4 ± 2． 0

50． 6 ± 2． 3

70． 5 ± 2． 6

86． 3 ± 2． 7

4． 18 ± 0． 43

联合组

12． 6 ± 1． 8

33． 7 ± 2． 7

59． 7 ± 1． 9

76． 8 ± 2． 1

88． 5 ± 3． 4

3． 47 ± 0． 60

72 h

单药组

53． 6 ± 2． 3

68． 1 ± 2． 4

86． 9 ± 2． 3

92． 3 ± 1． 8

94． 3 ± 2． 4

0． 82 ± 0． 10

联合组

58． 2 ± 2． 5

74． 2 ± 2． 1

89． 7 ± 1． 8

94． 8 ± 2． 4

96． 0 ± 3． 5

0． 68 ± 0． 24

2． 2 顺铂单药及联合 MCP 用药对 A549 细胞凋亡的影响 取 48 h 的 IC50 浓度( 14． 73 ± 0． 11) mmol /LDDP 作用 6 h 24 h 48 h 后， 分别进行流式细胞检测， 结果见图 1 可见随着时间延长， A549 细胞凋亡率逐渐升高， 且联合组的细胞凋亡率明显高于单药组。

2． 3 DDP 单药及联合 MCP 用药对 A549 细胞凋亡相关蛋白的影响 取 IC50 浓度的 DDP 作用 6 h 24 h48 h 后， 分别进行 Western blot 检测， 结果显示，

procaspase- 3 8 9 开始活化， 呈时间依赖性 在同一时间点， 联合组A549 细胞procaspase- 3 9 蛋白表达水平低于单药组， 但 procaspase- 8 表达水平两组无显著差异， 见图2 图3。

3 讨 论

顺铂以 DNA 为主要作用靶点， 干扰 DNA 的复制与转录， 诱导肺癌细胞凋亡 肺癌细胞在治疗过程中可能通过一系列机制降低对顺铂的敏感性， 目前研究发现Gal- 3 可能参与并形成顺铂药物化疗敏感性降低及耐药形成: ( 1) Gal- 3 与 B 淋巴细胞瘤- 2( Bcl- 2) 基因具有一定的序列相似性， 其中一个序列可能与Bcl- 2结合， 假如此点突变， Gal- 3 失去抗凋亡能力( 2) Gal- 3发挥抗凋亡效应关键步骤是细胞核中 Gal- 3磷酸化后转移至细胞质 在高表达Gal- 3的卵巢癌细胞及胆管癌细胞中， 通过小干扰 RNA 转染敲除Gal- 3， 可以提高铂类药物对肿瘤细胞的杀伤性，前列腺癌细胞转染 Gal- 3 后， 顺铂可诱导细胞核 Gal- 3磷酸化并由转移细胞质或核周膜， 胞浆中磷酸化Gal- 3诱导促凋亡蛋白磷酸化， 调节 Bcl- 2 稳定线粒体膜电位， 抑制细胞色素 C 释放和procaspase- 3 激活， 到抗凋亡作用 乳腺癌细胞转染野生型Gal- 3 载体后经顺铂作用后同样诱导Gal- 3磷酸化后转移至细胞质，可能通过促分裂原活化蛋白激酶( MAPK) 途径抑制细胞凋亡。

MCP 是从柑橘类水果的果皮及果浆中提取出的水溶性多糖类化合物， 其主要在体内竞争性抑制Gal- 3配体， 能够有效封闭肿瘤细胞表面的Gal- 3 位点， 抑制肿瘤的发生 ,发展 .目前初步证实MCP 可以抑制肿瘤细胞黏附与转移， 并可能阻止肿瘤细胞形成异常的血供 Gal- 3 蛋白与铂类药物化疗敏感性，降低及耐药形成有关 MCP 通过抑制 Gal- 3 改善化疗药物的疗效已得到部分证明 MCP 在骨髓瘤 ,血管肉瘤前列腺癌 ,结肠癌细胞中均可提高化疗药物的敏感性， 与化疗药物起协同作用。 但目前尚缺乏MCP 改善顺铂化疗敏感性的研究， 故本实验就顺铂联合小分子柑橘果胶对肺癌细胞增殖与凋亡的影响做初步研究。

本研究发现， 顺铂在体外对肺癌细胞 A549 有明显的增殖抑制作用， 其抑制效应具有剂量依赖性 MCP与顺铂联合应用具有协同效应， 能够增加对 A549 细胞的抑制作用， 应用流式细胞仪显示联合组的 A549 细胞凋亡比例较顺铂单药组显著增加， 表明 MCP 能够增强顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡 在 Western blot 实验中我们分别检测顺铂单药与联合用药作用 A549 细胞6 h 24 h 48 h 的凋亡相关蛋白表达， 结果显示， 顺铂单用及联合MCP 均能有效增加procaspase- 3 的活化， 同时活化procaspase- 8 9 MCP 联合顺铂处理 A549 后较相同浓度相同时间的顺铂单用 procaspase- 3 9 的表达减少更加显著， 单药组与联合组之间procaspase- 8蛋白表达无显著差异 提示 MCP 可能通过线粒体途径增加顺铂诱导肺癌细胞 A549 凋亡。

综上所述， MCP 能够增加顺铂的细胞增殖抑制和促凋亡能力 在细胞水平上表现为增加肺癌细胞凋亡率， 在分子水平上促进 procaspase- 3 9 激活水平， 我们推测可能的机制是MCP 活化内源性凋亡通路， 提高顺铂的杀伤活力 MCP 作为一种天然无毒的药物，有望为肺癌和其他恶性肿瘤治疗开辟新的途径。

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