WB的常见问题!

问题

可能原因

建议

电泳条带成笑脸状

胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高

减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳

电泳条带成皱眉状

可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全

调整装置

拖尾

样品溶解不好

样品充分溶解混匀后上样

纹理(纵向条纹)

样品中含有不溶性颗粒

样品充分搅拌混匀

条带偏斜

电极不平衡或者加样位置偏斜

调整电极和加样

条带两边扩散

加样量过多

适当减少上样量

Marker 变黑色

抗体和 Marker 蛋白反应

在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样

背景高

膜封闭不够

延长封闭时间，选择最适宜的抗体稀释度

一抗稀释度不适宜

对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度

一抗孵育的温度偏高

建议 4℃结合过夜

二抗浓度度过高

降低二抗浓度

二抗的非特异性背景

增加一个阴性对照

选择膜的问题

硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低

膜在实验过程中干过

实验过程中要注意保持膜的湿润

检测时曝光时间过长

注意曝光时间的缩短

洗膜不充分

增加洗膜的时间和次数

抗体和封闭蛋白有交叉反应

选择无交叉反应的封闭剂

杂带较多

目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小

目的蛋白有其他剪切本

查阅文献或生物信息学分析可能性

样品处理过程中目的蛋白发生降解

裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行

上样量过高，太敏感

适当减少上样量

一抗不纯

纯化抗体

一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体

二抗的非特异性结合

增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）

蛋白条带位置
 （大小）不对

二聚体或多聚体存在

增加蛋白质变性过程及强度

翻译后剪切

比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式

相对电荷

氨基酸电荷的组成

蛋白修饰

比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加

胶浓度

不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差

无蛋白条带

抗体孵育不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间

HRP酶失活

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。

标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

设置阳性对照。

二抗与一抗不匹配

选择针对一抗来源种属的抗体

蛋白条带信号弱

抗体孵育不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间

酶活性降低

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

洗膜过度

洗膜时间不宜过长

标本中靶蛋白含量太低

增加样本上样量

抗体活性降低

选择有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置

蛋白转移不充分

可以用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流

封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型

曝光时间过短

延长曝光时间

HRP 抑制剂

所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠

背景有黑色斑点

抗体与封闭试剂反应

使用前过滤封闭试剂

HRP 偶联二抗中有聚集体

过滤二抗试剂，去除聚集体

暗背景上白色带

HRP 含量过高

降低酶联二抗的浓度

背景有不均匀的白色斑点

转膜过程中有气泡存在

仔细检测，避免存在气泡

抗体分布不均匀

孵育抗体时使用摇床