大医循证 《白藜芦醇联合姜黄素对肝癌细胞的作用》论文及影视报道揭示:白藜芦醇、姜黄素联合使用可增强预防和抗癌作用!

北京卫视《我是大医生》栏目：关于白藜芦醇和姜黄素联合使用抗肝癌效果一加一大于二的的报道

［摘要］ 目的: 观察白藜芦醇联合姜黄素对体外人肝癌细胞SMMC-7721 增殖和凋亡的影响及相关信号通路。方法: 不同浓度白藜芦醇、姜黄素及两药联合干预SMMC-7721 细胞，MTT 法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡、Hoechst 33258染色检测细胞凋亡形态变化，比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶( caspase) -3，caspase-8，caspase-9 酶活性，Western blot 法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶切割底物( PARP) 。结果: 与对照组相比，白藜芦醇、姜黄素单独或联合作用SMMC-7721 细胞均可抑制SMMC-7721 细胞增殖，两药联合后抑制作用更显著。白藜芦醇、姜黄素联合较单独用药可增强SMMC-7721 细胞凋亡，呈现凋亡形态改变，白藜芦醇、姜黄素及联合组细胞凋亡率分别为( 17. 39 ± 1. 41) % ，( 14. 96 ± 2. 23) % ，( 25. 36 ± 2. 68) % ; 同时提高SMMC-7721 细胞caspase-3，c aspase-8 及caspase-9 活性，促使PARP 蛋白剪辑。结论: 白藜芦醇、姜黄素联合使用可增强对人肝癌细胞SMMC-7721 的抗癌作用，并可能与caspase-8，caspase-9 / caspase-3 /PARP 信号通路介导细胞凋亡相关。

［Abstract］ Objective: To observe the combinational effects of resveratrol and curcumin on cell proliferation，apoptosis and the possible mechanisms in human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells in vitro．

Method: SMMC-7721 cells were treated with resveratrol or curcumin or both． Cell proliferation was detected by MTT assay． Cell apoptosis was detected by flow cytometry，apoptotic morphology was visualized by hoechst 33258

staining． Caspase-3，caspase-8 and caspase-9 activities were detected by colorimetric assay，and cleaved poly( ADP-ribose) polymerase ( PARP) was detected by Western blot． Result: Compared with the control，resveratrol

and curcumin significantly inhibited the proliferation of SMMC-7721 cells． The combination of resveratrol andcurcumin was found to be more effective in inhibiting growth ( P ＜ 0. 01) ，and inducing apoptosis in SMMC-7721

as indicated by apoptotic morphological change and PI /Annexin V-FITC staining． The apoptosis rate of resveratrol，curcumin and combination group was ( 17. 39 ± 1. 41 ) % ， ( 14. 96 ± 2. 23 ) % ， and ( 25. 36 ± 2. 68 ) %

respectively． In addition， caspase-3， caspase-8 and caspase-9 were significantly activated by combinationaltreatment of resveratrol and curcumin，accompanied by increased PARP cleavage，and compared with either agent

alone． Conclusion: Combination of resveratrol and curcumin may elicit synergistic anti-cancer effects in human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells，and associated with caspase-8，-9 / caspase-3 /PARP mediated apoptosis．

［Key words］ hepatocarcinoma; resveratrol; curcumin; apoptosis; caspases; PARP

［收稿日期］ 20111031( 009)

［基金项目］ 上海市基础研究重点项目( 09JC1413600) ; 龙华医院国家中医临床研究基地“龙医团队、龙医学者”项目( LYTD-04)

［第一作者］ 杜琴，硕士，从事中西医结合肿瘤基础与临床研究，Tel: 021-64385700，E-mail: lsduqin123@ 126． com

［通讯作者］ * 胡兵，博士，副研究员，硕士生导师，从事肿瘤生物学、功能基因组与抗癌中药作用及配伍研究，Tel: 021-64385700，E-mail:

beearhu@ hotmail． com

白藜芦醇( resveratrol，Res) 为蒽醌萜类化合物，来源于食品葡萄及中药虎杖等，具有预防和治疗癌症及抗肿瘤作用［1-3］; 姜黄素( curcumin，Cur) 来源于姜科植物郁金、姜黄、莪术等根茎提取物，在肿瘤的起始、进展过程中均有一定的预防和治疗作用［4-5］; 但未见白藜芦醇联合姜黄素对肝癌细胞作用的研究报道。在中药配伍理论指导下［6］，本研究在人肝癌SMMC-7721细胞模型中，观察了白藜芦醇联合姜黄素对SMMC-7721 肝癌细胞的抗癌作用及可能机制。

1 材料

1. 1 细胞株及细胞培养人肝癌SMMC-7721细胞购自中国科学院细胞库，培养于含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基( 含青、链霉素各100 U·mL － 1 )中，37 ℃，5% CO2饱和湿度环境的条件下连续培养。取对数生长期细胞用于以下实验。1. 2 试剂RPMI 1640 培养基和胰蛋白酶由Gibco公司提供，胎牛血清为SAFCBiosciences 产品，二甲基亚砜( DMSO) 为国产分析纯。白藜芦醇( 纯度≥99% ) 及姜黄素( 纯度≥94% ) 购于Sigma 公司，均用DMSO 溶解、稀释，各组DMSO 体积一致; MTT 为Amresco公司产品，AnnexinV-FITC 凋亡检测试剂盒及细胞凋亡荧光Hoechst 33258 检测试剂盒购于凯基生物，caspase-3，caspase-8和caspase-9酶活性检测试剂盒均购于碧云天生物技术研究所，兔抗鼠PARP 抗体、β-actin 抗体购自Cell SignalingTechnology 公司。

1. 3 仪器美国NAPCO-5410型二氧化碳培养箱，酶标仪( 美国Thermo Varioskan 公司) ; DXM1200型倒置显微镜( 日本Nikon ) ; 流式细胞仪( 美国BDcalibur 公司) ，电泳和转膜装置( 美国BIO-RAD 公司) ，Odyssey双色红外荧光成像系统扫描仪( 美国LI-COR) 。

2 方法

2. 1 细胞增殖检测取对数生长期SMMC-7721细胞，常规胰酶消化，调整细胞密度，按4 000 个/ 孔接种细胞于96 孔板中，贴壁24 h 后加入不同浓度白藜芦醇和姜黄素，对照组加入等体积DMSO，空白组不做处理，每组3 个复孔。继续培养48 h 后，每孔加入新鲜配制的质量浓度为5 g·L － 1 的MTT 溶液20μL，孵育4 h 后弃培养基，每孔加DMSO150 μL，轻轻振荡10 min，用酶标仪于490 nm 处检测各孔吸光度( A) 值，按公式计算细胞存活率细胞实验重复3 次。存活率= ( A实验－ A空白) / ( A对照－ A空白) ×100%

2. 2 Hoechst 33258 染色对数生长期SMMC-7721 细胞常规胰酶消化，调整细胞密度，以2 × 104个/孔细胞密度接种于24 孔板中，24 h 后实验组分别加入终浓度40 × 10 － 6 mol·L － 1 白藜芦醇、10 ×10 － 6 mol·L － 1 姜黄素及两药联合加入组，对照组加入等体积DMSO，继续培养48 h 后弃培养，PBS 洗涤2 次，加入Hoechst 33258 室温染色5 min，荧光显微镜观察并拍照。

2. 3 流式细胞仪检测收集各组药物干预48h 后SMMC-7721 细胞，PBS 洗涤3 次，调整细胞密度至4 × 105 /mL，离心2 000 r·min － 1，5min，加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，依次加入5μL AnnexinV 混匀，再加入5 μL PI 充分混匀，避光15 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

2. 4 Caspases 活性检测常规胰酶消化SMMC-7721 细胞，以1 × 106 个/ 孔接种于60 mm 培养皿中，24 h 后实验组分别加入终浓度40 × 10 － 6 mol·L － 1 白藜芦醇、10 × 10 － 6 mol·L － 1 姜黄素及两药联合加入，对照组加入等体积DMSO，每组设3 个平行孔，收集药物作用48 h 后SMMC-7721 细胞，常规裂解，离心去除DNA，提取细胞蛋白，采用比色法测定caspase-3，caspase-8及caspase-9活性，具体操作参考试剂盒说明书进行。实验重复3 次。2. 5 Westernblot 收集药物作用后SMMC-7721 细胞，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液( 10 mg·L － 1PBS，1 %NP-40，1mmol·L － 1 EDTA，0. 5% 脱氧胆酸钠，0. 1%SDS) 裂解，4 ℃，16 000 r·min －1 离心15min，将上清液移至新的EP 管中，蛋白检测试剂盒定量。按比例加入蛋白上样缓冲液100 ℃ 变性15min，在8% 的SDS 聚丙烯酰胺凝胶中电泳，湿式电转法将蛋白质转移至硝酸纤维膜，5% 脱脂奶粉封闭后1 h 后，与PARP 或β-actin 抗体4 ℃ 孵育过夜，PBST 洗涤3 次后与荧光标记二抗37 ℃反应1 h，再次洗膜3 ～ 4 次后，Odyssey双色红外荧光成像系统扫描并保存图片。

2. 6 统计学处理所得实验数据采用SPSS16. 0统计软件进行统计分析，计量资料用珋x ± s 表示，组间比较用单因素方差分析，以P ＜ 0.05 为有统计学意义。

3 结果

3. 1 白藜芦醇和姜黄素对SMMC-7721细胞增殖影响MTT 实验结果显示，药物干预48 h 后，与对照组比较，不同浓度白藜芦醇及姜黄素实验组SMMC-7721 细胞增殖不同程度被抑制，见表1; 白藜芦醇、姜黄素联合作用组较单用白藜芦醇或姜黄素抑制作用更明显( P ＜ 0. 01) 。

见表2

3. 2 白藜芦醇和姜黄素对SMMC-7721细胞凋亡形态影响Hoechst33258 荧光染色结果显示，对照组SMMC-7721 细胞呈弱荧光染色，未见明显细胞核形态改变; 白藜芦醇和姜黄素作用48 h 后，SMMC-7721 细胞吸收Hoechst 33258 发出较强烈的蓝色荧光，细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色荧光颗粒，见图1。

3. 3 白藜芦醇和姜黄素对SMMC-7721细胞凋亡率的影响根据以上结果，进一步采用AnnexinV-FITC /PI 双标法观察了白藜芦醇和姜黄素对SMMC-7721细胞凋亡率的影响，白藜芦醇、姜黄素作用48 h 后，可促使SMMC-7721 细胞凋亡，两者联合作用后细胞凋亡率较单独用药明显增加，与对照组比较差异有统计学意义( P ＜ 0.01 ) ，见表3 ，图2。

 

3. 4 白藜芦醇和姜黄素对SMMC-7721细胞caspases活性影响白藜芦醇、姜黄素作用SMMC-7721细胞48 h，细胞中caspase-3，caspase-8及caspase-9活性显著增强，与对照组比较有明显统计学差异( P ＜ 0.01 ) ; 白藜芦醇与姜黄素合用组caspase-3，caspase-8及caspase-9活性提高较白藜芦醇或姜黄素单用差异有统计学意义( P ＜ 0.01 ) ，见表4。

3. 5 白藜芦醇和姜黄素对SMMC-7721细胞PARP活化影响Westernblot 实验结果显示，白藜芦醇及白藜芦醇联合姜黄素作用48 h 后，SMMC-7721 细胞PARP 剪切片段较对照组明显增加。见图3

4 讨论

肝癌是常见恶性肿瘤之一，在全球男性和女性中的发病率分别为第5 位和第7 位，肝癌在我国具有较高发病率及死亡率，并呈上升趋势［7］; 联合用药对提高中晚期肝癌疗效具有重要意义。本研究结果亦显示白藜芦醇、姜黄素均可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖，白藜芦醇与姜黄素合用可显著增强对SMMC-7721 细胞增殖的抑制，提示白藜芦醇联合姜黄素具有一定协同或增强抗肝癌作用。

细胞凋亡，即程序性细胞死亡( programmedcelldeath) ，是细胞在一定的生理或病理条件下，受内在基因调控的自动结束生命的过程，是药物治疗肿瘤的主要机制之一。凋亡细胞呈特殊性形态学改变，如染色质浓缩、凝聚，细胞核碎裂，产生凋亡小体等［8-9］。本研究发现白藜芦醇及姜黄素作用后细胞出现明显凋亡形态改变，SMMC-7721 细胞吸收Hoechst 33258，发出强烈的蓝色荧光，细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色荧光颗粒及明显核形态变化;同时Annexin V-FITC /PI 染色结合流式细胞仪检测结果显示，白藜芦醇联合姜黄素可将凋亡率由对照组4. 2% 提高到25. 36% ，提示白藜芦醇联合姜黄素可显著促使SMMC-7721 细胞凋亡，参与抗肝癌作用。

目前研究证实，细胞凋亡主要有内源性( intrinsic pathway) 和外源性( extrinsic pathway) 两种通路，caspase-3 是内外源通路细胞凋同执行蛋白酶，在正常细胞中caspase-3以酶原形式存在于胞浆，细胞凋亡早期阶段，caspase-3 被上游信号激活:外源性通路中，胞外配体( 如FasL /TRAIL 等) 结合死亡受体( 如FAS /TRAIL-R 等) 发生寡聚化，活化FAS 相关死亡域蛋白( FADD) ，通过募集caspase-8形成死亡信号诱导复合物，活化caspase-8 可激活下游caspase-3 等凋亡执行蛋白; 内源性通路中，caspase-9 是其重要的始动因子，caspase-9 前体与细胞色素C( cytoC) 、凋亡蛋白酶激活因子1( Apaf1) 形成凋亡复合体并发生自我活化，活化后激活caspase-3［8-9］。活化caspase-3 进而裂解下游蛋白底物如PARP，将PARP 剪切为89 × 103 和24 × 103 2个片段，失去DNA 修复功能，诱发细胞凋亡［10-12］。

本实验结果显示，白藜芦醇联合姜黄素可活化SMMC-7721 细胞caspase-3，caspase-9，caspase-8，导致PARP 剪切，提示白藜芦醇联合姜黄素可通过内外源通路促使SMMC-7721 细胞凋亡。

研究结果显示白藜芦醇、姜黄素可一定程度抑制SMMC-7721细胞增殖，诱导细胞凋亡; 白藜芦醇与姜黄素合用较单独用药可显著抑制SMMC-7721细胞增殖，诱导细胞凋亡，可能与活化caspase-8，caspase-9，caspase-3 活性及PARA 相关。

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［责任编辑:邹晓翠］

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