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芦荟大黄素联用顺铂对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

陶毅明^1*，洪雪²，马义丽¹，廖朝亮¹

(1. 桂林医学院生物技术学院，桂林 541004;

2. 广东省肾病研究所，广州 510515)

[摘要] 目的：探讨芦荟大黄素(AE)单用或联用顺铂(CP)对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响。方法：以MDA-MB-231细胞为研究对象，用5，10，20，30，40，50 μmol·L^-1AE，2，4，8，12，24，36 μmol·L^-1CP，或不同浓度AE联用CP处理乳腺癌MDA-MB-231细胞48 h，另设空白组，MTT法检测细胞增殖；Annexin V FITC/PI双染和流式细胞术检测细胞凋亡与细胞周期；Westernblot分析Bcl-2相关X蛋白(Bax)，B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-XL蛋白表达的变化。结果：与空白组比较，AE单用显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖，半数抑制浓度（IC₅₀）为22.21 μmol·L^-1，与CP联用时IC₅₀为9.51μmol·L^-1。联用指数CI₅₀<1，表明两药物有协同作用；AE单用使细胞周期阻滞在G1期，并诱导细胞凋亡，联用CP则增强阻滞，凋亡率明显增加；两药联用显著抑制Bcl-2和Bcl-xL的表达，并上调Bax的表达，与空白组比较均具有明显的统计学差异（P<0.05，P<0.01）。结论：芦荟大黄素抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，使细胞周期阻滞在G1期，并通过上调促凋亡蛋白和下调抗凋亡蛋白，诱导凋亡。与顺铂联用能增强其促凋亡作用，两药存在协同作用。

[关键词] 芦荟大黄素；乳腺癌；MDA-MB-231细胞；凋亡；顺铂

Effects of Aloe Emodin Alone and in Combination with Cisplatin onCell Proliferation and Apoptosis of Breast Cancer Cell Line MDA-MB-231

TAOYi-ming¹, HONG Xue², MA Yi-li¹, LIAOChao-liang¹

(1. Guilin Medical University, College ofBiotechnology, Guilin 541004,China;

2. Guangdong Institute of Nephropathy, Guangzhou510515,China)

[Abstract]Objective: To investigatethe anti-proliferation and apoptosis effects of aloe emodin (AE) alone and incombination with cisplatin (AE-CP) on breast cancer cell MDA-MB-231. Method: MDA-MB-231 cells were treatedfor 48 h with 5, 10, 20, 30, 40, 50 μmol·L^-1AE, 2, 4, 8, 12,24, 36 μmol·L^-1CP orvarious concentrations of AE-CP. Cell proliferation wasdetected by MTT. Apoptosis and cell cycle were detected by Annexin V FITC/PI double-stainingand flow cytometer. The protein levels of Bax, Bcl-2 and Bcl-XL wereanalyzed by Western Blot. Result: AEalone significantly inhibited cell proliferation, with an IC₅₀ of 22.21μmol·L^-1. IC₅₀decreased to 9.51 μmol·L^-1 when it was used in combination with CP. The combinationindex CI₅₀<1,indicating a synergic effect. AE alone arrested cell cycle in G1 phase andinduced apoptosis. The arrest was accentuated when CP was given simultaneously,accompanied by a marked increment of apoptosis rate. AE-CP significantlyinhibited the protein levels of Bcl-2 and Bcl-xL, but increased Bax. Conclusion: AE could inhibit the cellproliferation of MDA-MB-231, arrest the cell cycle in G1 phase, and induceapoptosis by increasing apoptosis proteins and decreasing anti-apoptosisproteins. AE shows a synergic effect of apoptosis when combined with CP.

[Key words] aloeemodin, breast cancer; MDA-MB-231 cell; apoptosis; cisplatin

芦荟大黄素(aloe emodin, AE)是从传统中药植物包括芦荟、大黄等提取的一种蒽醌化合物，化学名为1,8-二羟基-3-羟甲基蒽醌， 具有抗菌、抗病毒、抗炎和护肝等作用。近十年来，研究表明AE具有抗多种肿瘤细胞的作用，且毒副作用小，安全性比化疗药物高，与其他化疗药物联用可增强疗效，逆转癌细胞由于化疗引起的耐药性^[1-2]。AE抗肿瘤的分子机制也得到初步阐明，包括细胞周期阻滞、活性氧簇ROS升高、线粒体凋亡途径、Caspase酶激活，Fas死亡受体表达增强等。但对于不同的细胞株，其作用机制不尽相同^[2-4]。AE对乳腺癌细胞的抑制研究尚未见报道。

凋亡是细胞的程序性死亡，通过凋亡，机体内的异常细胞得以清除。使用药物去诱导癌细胞凋亡是一种重要的治疗方式。凋亡受到诸多蛋白质的调控，包括促凋亡因子Bax、Bid和Bad等及抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL等^[5]。本文初步探讨了AE对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制及诱导凋亡作用，并分析药物处理前后凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2和Bcl-xL的表达变化情况，为其在中西医结合治疗乳腺癌的应用提供理论基础。

1 材料

1.1 细胞株 乳腺癌细胞MDA-MB-231购于中国科学院上海细胞库。

1.2药物及试剂 芦荟大黄素（纯度>95%，上海生工生物工程公司，批号LC1121S2011Z），顺铂（山东德州德药，批号111203），ECL发光液（美国Thermo公司，批号NJ175924），胎牛血清（美国Hyclone公司，批号NXA0544），细胞裂解液（南京碧云天公司，批号POO13B），DMEM培养液（美国Gibco公司，批号8114129），Bax抗体（批号2104742），Bcl-2抗体（批号2209630），Bcl-xL抗体（批号2299725），HRP标记羊抗鼠二抗（批号106386）和Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（批号3223842）均为美国BD公司，RNA酶（批号011M7028V），胰酶（批号1408168）均为美国Sigma公司。

1.3仪器 3111型CO₂恒温细胞培养箱（美国Thermo公司），1510型酶标仪为（美国Thermo公司），BSC-1500IIA2型生物安全柜（美国Biobase公司），BD FACSAria III型流式细胞仪（美国BD公司）

2 方法

2.1细胞培养 细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。培养条件为37 ℃，5% CO₂。

2.2药物配制 AE用DMSO溶解配成80 mmol·L^-1母液后，于–20 ℃保存。临用时用培养液稀释。最高浓度为50 μmol·L^-1 AE的培养液中含0.06% DMSO(V/V)，对细胞生长无影响。

2.3 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的细胞，接种在96孔板上，每孔5×10³个，每组6个重复。培养24 h后，加入100 μL AE或CP，终浓度分别为5，10，20，30，40，50 μmol·L^-1 AE，或2，4，8，12，24，36 μmol·L^-1CP，或不同浓度的AE与CP联用。再培养48 h后，每孔加入20 μL 5 g·L^-1 MTT，孵育4 h，弃MTT后加入150 μL DMSO振荡充分溶解后在酶标仪波长490 nm处测吸光值A。抑制率=(A_空白组－A_药物组)/A_空白组×100%。IC₅₀由SPSS12.0回归分析得出。药物联用指数(CI)按Chou-Talalay公式计算^[6]，CI_x=A_联x/A_单x+B_联x/B_单x，式中CI_x为抑制率为x%时的联用指数；A_联x和B_联x分别为抑制率为x%时，药物联用中A和B的浓度；A_单x和B_单x分别为抑制率为x%时，单用药物A和B的浓度。

2.4流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 取对数生长期的细胞，接种在6孔板上，每孔2×10⁵个。培养24 h后，加入AE或CP，终浓度分别为30 μmol·L^-1 AE，12 μmol·L^-1CP，30 μmol·L^-1 AE+12 μmol·L^-1 CP，处理细胞24 h(早期凋亡检测)或48 h(周期检测)，用0.25%胰酶消化，收集细胞，离心弃上清，用冷PBS洗涤2次，再离心弃上清，加入500 μL binding buffer重悬细胞，最后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL 50 μg·mL^-1 PI，室温避光反应15 min后在流式细胞仪上检测凋亡率和细胞周期。每组3个重复。

2.5 Western blot检测 取对数生长期的细胞，接种在50 mL培养瓶内，每瓶5×10⁶个细胞。培养24 h后，加入AE或CP，终浓度分别为30 μmol·L^-1AE，12 μmol·L^-1CP, 30 μmol·L^-1 AE+12 μmol·L^-1 CP，处理细胞48 h，细胞经裂解液作用后，离心收集蛋白上清液，BCA法测定蛋白质浓度后进行SDS-PAGE电泳。每孔蛋白上样量为40 μg。分离胶浓度为10%。电泳后将蛋白转移至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭过夜。次日加入一抗，室温孵育2 h，用TBST洗涤后，加入二抗。室温孵育2 h。暗室中用ECL发光，压片。以β-actin为参照，对蛋白条带灰度进行定量。每组3个重复。

2.6 统计学分析 采用SPSS 12.0软件进行分析，数据以`x±s表示，组间比较采用One-WayANOVA单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 AE单用或联用CP对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用 不同浓度的AE和CP单独作用细胞48 h后，抑制率随药物浓度的增加而增大，AE单用时IC₅₀为22.21 μmol·L^-1，CP单用时IC₅₀为11.05 μmol·L^-1。20~40 μmol·L^-1 AE与12 μmol·L^-1CP的抑制效果相当。联用时AE的IC₅₀为9.51 μmol·L^-1，是单用的42.8%(9.51/22.21)；CP的IC₅₀为3.96 μmol·L^-1，是单用的35.8%(3.96/11.05)。50%抑制率的联用指数CI₅₀=0.428+0.358=0.786<1，表明药物AE和CP间有协同作用。见表1。

表 1 AE单用或联用CP对MDA-MB-231细胞增殖的影响(`x±s，n=6)

Table1 Effects of AE and CP on proliferationof MDA-MB-231 cell line(`x±s，n=6)

CP /μmol·L-1	抑制率 /%	AE /μmol·L-1	抑制率 /%	AE+CP /μmol·L-1	抑制率 /%
2	5.12±1.81)	5	16.67±1.82)	2.5+1	17.72±3.32)
4	11.42±5.42)	10	45.32±3.32)	5+2	43.68±4.82)
8	32.63±6.72)	20	52.14±4.12)	10+4	52.67±6.72)
12	54.02±7.92)	30	55.32±4.22)	20+8	60.78±5.92)
24	80.20±9.32)	40	57.84±3.82)	30+12	67.89±8.82)
36	90.89±6.82)	50	62.12±3.92)	40+24	89.23±7.72)

注：与空白组比较¹⁾P<0.05，²⁾P<0.01（表2~3，图2同）。

3.2 AE单用或联用CP对乳腺癌MDA-MB-231细胞周期的影响 采用PI标记流式细胞术检测细胞周期的变化，经药物处理48 h后，30 μmol·L^-1 AE和12 μmol·L^-1CP处理组G1细胞的比例从57.71%分别增加至62.14%和68.85%，与空白相比差异显著(P<0.05)，说明AE对乳腺癌细胞MDA-MB-231的周期影响和CP相同，两者都使细胞分裂阻滞在G1期。联合用药则使G1期的细胞数目比例大大增加，达到了86.16%，S期和G2期的细胞数目比例大大减少，与空白相比差异均极显著(P<0.01)。见表2。

表2 AE单用或联用CP对MDA-MB-231细胞周期的影响(`x±s，n=3)

Table2 Effects of AE and CP on cell cycle ofMDA-MB-231 cell line(`x±s，n=3)

组别	药物浓度 /μmol·L-1	G0-G1 /%	S /%	G2-M /%
空白	–	57.71±8.8	30.67±4.5	11.62±3.2
AE	30	62.14±8.61)	26.05±3.7	11.21±3.8
CP	12	68.85±7.42)	27.04±3.0	4.31±1.02)
AE+CP	30+12	86.16±9.12)	7.39±1.12)	6.45±1.42)

3.3 AE单用或联用CP对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响 用AnnexinV-FTIC双染法检测细胞凋亡。凋亡图中，Q2为晚期凋亡和坏死细胞，Q3为活细胞，Q4为早期凋亡细胞，实验结果表明(图1和表3)：30 μmol·L^-1AE或12 μmol·L^-1 CP单独作用MDA-MB-231细胞24 h后细胞早期凋亡率分别为8.2%和5.5%，与空白(0.6%)相比差异显著(P<0.05)；两药联用则可诱导17.7%细胞早期凋亡，与空白相比差异极显著(P<0.01)。与空白或两药单用对比，联用引起的晚期凋亡和坏死细胞比例(3.8%)也明显增加(P<0.05)。见表3。

表3 AE单用或联用CP对MDA-MB-231细胞凋亡的影响(`x±s，n=3)

Table3 Effects of AE and CP on apoptosis ofMDA-MB-231 cell line(`x±s，n=3)

组别	药物浓度 /μmol·L-1	活细胞 /%	早凋 /%	晚凋和坏死/%
空白	–	96.9±1.7	0.6±0.2	0.2±0.1
AE	30	91.3±3.91)	8.2±2.62)	0.8±0.21)
CP	12	92.6±3.81)	5.5±2.02)	1.3±1.12)
AE+CP	30 +12	79.2±6.72)	17.7±5.92)	3.8±1.92)

3.4 Western blot检测凋亡相关蛋白表达的变化 采用Western blot法检测单用AE或联用CP处理细胞48 h后，促凋亡蛋白Bax，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达。结果如图2所示：与空白(CK)相比，AE单用显著抑制Bcl-2和Bcl-xL的表达，表达量分别为空白的0.675和0.561；AE联用CP，表达量下降为空白的0.616和0.318。AE单用或联用CP则显著上调Bax的表达，降低Bcl-2/Bax的比例，说明AE诱导的乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡与抗凋亡蛋白下调以及促凋亡蛋白上调有关，与CP联用加强了这种趋势。见图1。

A.空白组；B.AE组；C.CP组；D.AE+CP组

图 1 AE和CP对MDA-MB-231凋亡蛋白的影响(`x±s，n=3)

Fig.1 Effects of AE and CP on levels of apoptosisrelated proteins in MDA-MB-231 cell line(`x±s，n=3)

4 讨论

我国传统医学认为，芦荟大黄素具有抗病毒、护肝等功效，且毒副作用小。目前国内外有关芦荟大黄素药效的研究非常活跃，已经从抗菌、消炎等领域，逐步扩展到肿瘤治疗领域。探究其诱导肿瘤细胞凋亡的机制，正在成为一个重要的研究方向。Chiu等^[7]的研究表明，芦荟大黄素通过激活Caspase家族蛋白诱导舌癌细胞SCC-4凋亡；Chen等^[8]和Liu等^[9]的实验证明，芦荟大黄素通过内源性线粒体途径诱导细胞凋亡，并抑制NF-kappa B途径来提高胰腺癌对化疗药物的敏感性。王耀先等^[10]认为大黄素诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡可能与死亡受体的表达增强有关。本文通过MTT法、流式细胞术，Western blot等方法初步探讨了芦荟大黄素对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及凋亡的影响。

本实验首先观察了芦荟大黄素对乳腺癌MDA-MB-231细胞株的毒性作用，结果显示芦荟大黄素对乳腺癌MDA-MB-231细胞株的生长有很好的抑制作用，与低浓度顺铂联用时可增强顺铂的抑肿瘤效果。虽然其IC₅₀是顺铂IC₅₀的2倍，但顺铂可引起严重的消化系统反应且具肾毒性，而芦荟大黄素则副作用小，且两药联用时可降低顺铂的使用浓度。进一步分析细胞周期发现，芦荟大黄素的细胞周期阻滞效应与顺铂相同，两者都使乳腺癌细胞阻滞在G₀-G₁期，阻止了细胞进入S期，从而减少了DNA复制，于是细胞有丝分裂受阻。两药联用则使得这种阻滞效应更明显。芦荟大黄素处理肝癌细胞Hep G2后，也表现为细胞周期阻滞在G₀-G₁期，这可能与p21和p53蛋白的诱导表达相关^[11]。

诱导肿瘤细胞凋亡是一种重要的治疗方案。本研究采用Annexin V FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡效应，发现芦荟大黄素作用细胞24 h后，早期凋亡细胞的比例增加(8.2%)，与顺铂联用则大大增加早期凋亡细胞的比例(17.7%)，同时晚期凋亡和坏死细胞的比例也有所增加(3.8%)。Bcl-2家族蛋白的主要功能是参与细胞凋亡的调控，依其功能可分为抗凋亡因子和促凋亡因子，前者包括Bcl-2和Bcl-xL，后者包括Bax和Bad等。Bax可增加线粒体内膜的通透性，导致细胞色素c大量释放到细胞质中，从而触发凋亡；而Bcl-2和Bcl-xL的作用正好相反，它们能与Bax相互作用使之失活^[5]。Western Blot的结果提示，芦荟大黄素诱导乳腺癌细胞凋亡与促凋亡蛋白Bax上调、抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL下调密切相关。

本实验初步证实了芦荟大黄素能显著抑制雌激素受体阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，使细胞有丝分裂阻滞在G1期，并能通过降低Bcl-2(Bcl-xL)/Bax的比例诱导细胞凋亡。与顺铂联用能增强芦荟大黄素诱导凋亡的作用，两药存在协同作用。由于凋亡途径涉及因子诸多，同时芦荟大黄素对于雌激素受体阳性的乳腺癌细胞株的效果如何，这些都有待更深入的研究。

[参考文献]（略）