【实验入门】第十二讲 Western Blotting之抗体孵育和显色(大结局)
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小白讲实验，带你走进科研殿堂，助你从实验小白变身科研达人实验小白
上一讲呢，小白给大家介绍了WB的第三步：转膜。这一讲小白接着跟大家说WB的最后两步：抗体孵育和显色。
在第九讲的时候小白提到过，蛋白、一抗和二抗是三个手拉手的小盆友，只要我们能检测到二抗，那蛋白自然就“现形”了。经过第三步的转膜，蛋白已经被“粘”在膜上了，接下来要做的就是用一抗抓蛋白，再用二抗抓一抗。但是，在用抗体识别蛋白之前，有一件操作上很简单，但是意义却非凡的事情需要完成，那就是封闭。
封闭谁？拿什么封？小白还是要按照惯例来解释一下。
我们用来“抓”蛋白的膜不但可以结合蛋白，也同样可以结合抗体，因为抗体说白了也是蛋白。如果我们把膜想象成一间教室，把教室里的座位想象成蛋白的结合点，假设教室里总共有100个座位，转完膜以后座位被样本中的蛋白占了50个，剩下50个空座位，这些空座位在孵育抗体的时候会跟抗体结合，这样我们通过检测二抗反映出来的阳性信号除了目的蛋白以外还包括了空座位，所以必须在孵育抗体之前把这些空座位“占了座”才行。常用的“占座”神器有两种，一种是脱脂牛奶，另一种是牛血清白蛋白（BSA），从名字上也能判断得出BSA比较贵，所以小白至今也只用过脱脂牛奶。小白认识的一些小伙伴有用过BSA的，感觉除了不是很舍得用以外区别不大。
封闭这一步的操作非常简单，简单到让你怀疑它的效果。我们只要把转好的膜用镊子夹进5%脱脂牛奶（容器用培养皿即可，用BSA的白菜们这一步可以用封口膜代替培养皿，不然一瓶BSA没几天就用光了），放上摇床（慢速），塞进37℃孵箱，半个小时以后掏出来就完成了。
下面我们开始说说抗体孵育。由于抗体（尤其是一抗）比BSA要贵的多，所以孵育抗体妥妥的要用封口膜（如上图左所示，封口膜三面开口，我们的目标是把它做成一个完全封口的袋子）。
白菜们先把封闭好的膜放进封口膜的两层膜中间，用封口机（如上图右所示）把开口的三面中的两面封住，留一个口用来加抗体。
抗体都是稀释使用的，稀释的比例在抗体说明书上有，但是一般的说明书给出的抗体稀释比例都是一个范围，小白建议，第一次检测某种蛋白的话，白菜们可以使用最低稀释浓度，先做出来再说，做出来了后面慢慢优化条件。稀释抗体也用5%脱脂牛奶（心大的话直接从封闭用的牛奶里吸一点用，谨慎点的话还是用新鲜的牛奶吧）。
白菜们按照说明书稀释好一抗，然后把一抗加进只剩一个口的封口膜，排排气泡就可以封口了。有时候看似封好的膜还是会有点漏，所以小白习惯在外围再封一层以防万一。
最后把封口线外围多余的封口膜减掉，封口袋完成！为了让膜上的蛋白均匀地接触到抗体，我们要把封口袋贴在能左右颠倒的摇床上或是能旋转的转盘上（如下图）。
贴好封口袋的摇床或转盘放4℃过夜（一抗孵育过夜）。
第二天把封口袋卸下来，用剪刀开口，取出膜。
现在的膜浑身都是一抗，所以我们需要把多余的一抗洗洗干净，用什么洗呢？用PBST（PBS+0.1% Tween 20）洗。把孵完一抗的膜用眼科镊夹到培养皿里（或者用现在市售的小塑料盒，这个塑料盒原本设计用来孵育抗体的，但是小白以为用盒子孵育抗体实在太浪费了，盒子用来给膜洗澡都够了），倒上适量的PBST，摇床上摇3min。3min后换新的PBST继续洗，总共洗5次。
洗完一抗，把膜掏出来，按照一抗孵育的操作进行二抗的孵育，同样是用封口袋，把膜和稀释好的二抗放进去，然后粘在摇床或转盘上。接下来不是放冰箱，而是放37℃孵箱，孵育50min即可。关于二抗的稀释比例同样参照说明书，但是由于二抗跟一抗结合相对容易，所以就算是第一次检测也没必要使用最低稀释比例，不然做出来的背景会比较深，小白的习惯是用中间稀释比例。50min过后，把膜取出来，同样还是用PBST，3min一次，洗5次，把多余的二抗洗掉，接下来就可以显色啦。
关于显色的原理小白在第九讲里已经提到过，说白了就是底物和酶的反应。酶是连在二抗上的，而底物是需要白菜们提前买回来的。现在市面上有灵敏度很高的底物，如果白菜们检测的蛋白表达量很低的话不妨可以试试。
除此之外，白菜们还需要找到一套叫做“凝胶成像系统”的设备，用来给反应的产物“拍照片”。老早以前“拍照片”这个过程真的是在暗室拍照、显影的，最后洗出来是一张张胶片，不过小白从来没试过在暗室里显色，所以如果白菜们所在实验室还是用老式方法的话，小白真的帮不上忙了。但是话又说回来了，就算白菜们也用“凝胶成像系统”，小白在这里也没办法讲解使用方法，因为涉及软件的操作，所以白菜们还得就地找个会操作的大侠教一下成像系统怎么用，其实不难的。
我们言归正传，洗完二抗，我们要把膜放到成像系统中拍照，大致程序是这样的：先拍个肉眼所见的膜的样子，目的是用来记录marker的位置，然后保持膜的位置不动，加底物（或者叫显色液）反应，最后拍一张肉眼看不见的显色后的膜的样子，用来看蛋白条带。我们具体来说说怎么操作。
刚洗完的膜湿哒哒的，如果直接放到系统里会污染仪器，所以小伙伴们习惯垫个东西，常用的就是抗体孵育的时候用来做封口袋的封口膜，撕开一张就可以用。把待显色的膜正面朝上放到撕开的封口膜上，至于哪一面是正面，摸不清头脑的白菜们可以回顾一下第十一讲转膜的内容，如果放反了，很可能啥都显不出来。
然后提着封口膜放进成像系统，打开软件，白光下拍一张肉眼所见的膜的照片，拍完的照片上应该清晰地显示了marker的条带。
接着要加显色液，白菜们先别急，这里小白要强调一件事，我们买回来的显色液有一白一棕两个瓶子，分别称为A、B液，这两种液体使用的时候需要混合在一起，但是一定是现用现混，混早了就失效了。所以我们在需要显色之前，找一个小EP管，吸取适量的（吸多少A吸多少B请看说明书）A、B液在EP管中混匀（用多少显色液请白菜们看膜的大小，能覆盖整张膜就可以了，多了浪费而且会撒得到处都是，不要贪心，差不多就行了，1ml以内基本均可搞定），吸取A、B液一定一定要用不同的枪头，否则就相当于提前混匀了整瓶A、B液，白菜们一定要小心啊。把混匀好A、B液加到正面朝上的膜上，用滴加的方式将整张膜铺满显色液，静静地等待3-5min让酶和底物反应，整个加显色液的过程中不要移动膜，不然很可能对不上marker，影响结果判断。
反应完，调整软件模式（可能不同的软件使用的模式不一样，白菜们请大侠传授一下），曝光显影，如果白菜们看到像下图那样好像小新的眉毛一样的条带，并且对照刚才拍的marker，所得条带位置正确的话，那就说明你成功啦！
WB的内容到这一讲为止就全部结束了，如果白菜们还有什么要交流的可以给小白留言。下一讲呢，小白打算跟大家说说免疫组化，不过小白提前打个招呼，由于小白的组化实验做的不多，经验也比较少，有说的不好的地方请大家多多提点和交流。
1. 5%的脱脂牛奶用脱脂奶粉和PBST按照质量体积比（m/v）配制。国内的脱脂奶粉为了制造噱头卖个好价钱，总喜欢添加各种各样的元素，比如镁、钙什么的，小白不确定这些元素会不会对WB的结果造成什么影响，但是小白是一个宁可信其有的人，所以小白一直用的是进口脱脂奶粉。
2. PBST配制的时候，Tween 20因为黏稠度很高，不好吸，所以小白建议白菜们把枪头剪秃了再吸。尽管这样，吸取的过程还是要慢慢的，不然很容易吸不准。
3. 有很多小伙伴非常纠结加完抗体以后的排气泡过程，誓要排的一干二净。小白发自肺腑地跟大家说，其实这一步的气泡真心不要紧，就算非常大胆地不排气泡影响也不会太大，因为在孵育抗体的过程中气泡是不停窜动的，就算将来曝出来的条带上有气泡，那也很可能是转膜造成的，不要随随便便怪罪到封口袋里的气泡身上。但是为了以防万一，气泡排还是要排的。
4. 关于加到封口袋里的稀释抗体的体积，小白个人的信仰是节约优先、浪费可耻。以小白的经验，1ml的稀释抗体可以满足大多数人的要求，小白平时五、六个泳道的膜一般只用500-700μl，白菜们放心，抗体的量绝对是足够的，所以只要保证膜的每个角落都能接触到抗体就可以了。
5. 一抗孵育的条件，小伙伴们普遍采用的就是4℃过夜，也有实验室采用37℃，2h，这样一来可以大大缩短WB的操作时间，一天之内就可以做完一套WB。但是37℃，2h这样的孵育方式并不适用于所有蛋白或所有抗体，换句话说，37℃，2h并不是一个稳定而有效的孵育一抗的方式，小白曾经试过，有些蛋白做不出来，所以白菜们慎重选择。如果白菜们要测的蛋白表达量非常少，很难检测，可以考虑延长一抗孵育的时间，可能会有惊喜。小白的记录是4℃孵育一抗三天两夜，所以白菜们可以放手一搏，小白认为只要牛奶不长毛应该都是可以的，哈哈，开个玩笑。
6. 白菜们可能会遇到某些一抗很珍贵，做完一次WB就扔了非常可惜，那小白可以告诉白菜们，有些小伙伴喜欢把孵育过一次的一抗回收起来，近期再次使用，据说效果还可以，不过小白没有试过。
7. 二抗的浓度不宜太高、孵育时间不宜过长，否则背景会漆黑一片，当然如果是第一次做可以先尝试一下浓度高一点、孵育时间久一点，做得出来才是王道，优化条件那是锦上添花的事情。
8. 洗抗体的方式其实可以很任性，3min/次×5次是一种常规用法，多洗几次，每次多洗点时间都是可以的，就算一次洗上一个小时也没什么，反正PBST还没有能力把结合好的抗体和蛋白洗掉下来，但是洗少了或者洗的时间短了倒是可能会对结果有影响。
9. 曝光的时间不是一成不变的，对于表达量高的蛋白，曝光时间可以短一些，对于表达量低的蛋白，曝光时间就长一些，有些表达量很低的蛋白需要曝光几分钟甚至十几分钟才行，所以白菜们一定要沉住气。
10. 如果用来做WB的样本很珍贵，并且需要检测好几种蛋白，那么白菜们要看情况了，如果要检测的蛋白之间分子量相差比较大可以有两种选择：①、把膜剪开，让不同的蛋白在不同的膜上；②、不剪膜，蛋白在同一张膜上。对于①，小白就不多说了，每张膜分开孵育抗体就行。对于②，白菜们还有两种选择：A、把抗体混到一起孵育（这种做法可能有风险，小白尝试过两种抗体一起孵育，可行，但不保证其它情况也可以，慎用）；B、孵育完一种抗体、曝光，PBST洗，再孵另一种、再曝光（这种做法比A保险一点，就是耗时）。如果要检测的蛋白之间分子量挨得很近，那只有一种选择：孵育完一种抗体、曝光，用一抗二抗洗脱液（有的卖，很便宜。请注意是洗脱液不是PBST）洗，再孵另一种、再曝光。当然对于分子量相差比较大的蛋白也可以用洗脱液的方法，这样可以保证上一次的检测几乎不对下一次检测产生干扰，但是小白要提醒白菜们，洗脱液的作用就像铲子一样，它不光会铲掉抗体，它连蛋白也会顺带铲掉一点点，所以用了洗脱液以后，就变相地减少了蛋白的量了，如果白菜们要检测的蛋白量比较大，那倒是可以任性一些，如果蛋白量本身就少，还是要好好考虑一下的。正是因为洗脱液有这种不顾一切的“铲”性，白菜们在使用洗脱液之前一定要考虑好蛋白检测的顺序，一定要把表达量少的、难检测的蛋白放在前面检测，让洗脱液去“铲”那些表达量本身就很高的蛋白，如内参，这些蛋白反正多，铲铲也无伤大雅。
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