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来聊另一个五毛钱的Western Blot

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聊另外五毛钱Western Blot

前面小编讲到了四类Western Blot实验经验,今天小编再跟大家聊聊另外五种Western Blot实验经验~

五:关于“白板”和“黑板”

Western结果往往就处于“白板”与“黑板”之间的某个条件:

1. 白板:“白板”代表的意义是某些条件不足:① 首先要考虑蛋白提取问题,样本浓度是否过低,正常Western实验每孔需要20-40μg左右的蛋白;②一抗的稀释比例,一般新手做WB都会按照说明书的比例去做,一般说明书都是1:500-2000之间的比例,如果是白板就需要加大抗体比例,如果按说明书的最低推荐比例还是“白板”,那应该不是稀释比例的问题了;③一抗孵育时间,常规的一抗孵育条件是4℃过夜,有时候抗体反应比较“迟钝”可能需要更强烈的孵育时间,比如延长孵育时间至2天,或者把摇床放入冰箱缓慢摇动孵育过夜,我们不建议37℃进行抗体孵育;④ 显色体系的选择,一般来说ECL化学发光要比DAB灵敏5-10倍以上,所以尽量使用ECL;ECL发光液也分很多种,普通型、灵敏型、超灵敏型,我们都尝试过,的确在信号上有非常明显的差异;当然延长曝光时间也是提高信号灵敏度最常规的方法;
2. 黑板:“黑板”顾名思义相对于“白板”,“黑板”代表的意义就是某些条件过量了;① 要考虑上样量;② 降低一抗稀释比例;③降低二抗稀释比例,二抗其实是非常成熟的产品,质量是有保证的。总结起来还是一抗、二抗都要买放心厂家的;④ 缩短曝光时间。


六:关于封闭

封闭也是Western中比较关键的环节,一般常规的条件是5%脱脂奶粉溶于1×TBST中,常温下摇床缓慢摇晃,封闭1h;除此之外还需要向大家介绍另外一种封闭液—0.5% 明胶,这两种封闭液都适用于常规的Western实验,他们之间的取舍关系可近似认为,如果用脱脂奶粉封闭结果是“白板”或者信号较弱,可以考虑换明胶;如果用明胶封闭,结果杂带较多,背景较深可以考虑用脱脂奶粉;甚至有的时候两者可以混合起来使用,具体的细节需要大家在实验中细细品味。

七:缓冲液的选择,是用PBS/PBST,还是用TBS/TBST?


(1)PBS/PBST不适合AP系列,TBS/TBST适合AP和HRP体系。


(2)另外,做磷酸化蛋白的WB,PBS不合适


八:WB中抗体的选择和中Tween-20的作用:

单抗专一性高,但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别。多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。吐温是一种非离子型表面活性剂,可以洗掉一些非特异性结合的蛋白和抗体,降低背景。

九:ECL荧光淬灭的问题:

二抗浓度过高,HRP浓度过高,会超速催化底物生成产物使膜发黄。所以二抗浓度太低了不行,太高了由于会出现卒灭的现象也行不通。

常见问题及解决方法:

(1)弱信号或者无信号:在HRP极高的情况下,来不及压片就已耗竭底物!解决办法:加入底物后迅速进入暗室,压片10秒钟!或者适当降低2抗浓度。

(2)反影(白色条带,黑色背景) :条带处HRP很快将底物耗竭,则不发光,不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。解决方法同上。

(3)另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊,但条带中心是空的白色,原因和上面的一样,主要是条带中心耗竭底物引起的,也可以在暗室看到中空的荧光带,但与上面的区别主要在于特异性要好一些,若继续发展则就是弱信号或者无信号,解决方法同上。

 

western 背景深原因:

(1)封闭的不好。封闭试剂不合适等。

(2)洗涤不充分。洗涤液的量过低等。

(3)样品浓度过高。

(4)抗体浓度(特别是二抗浓度)过高。

 

Western中的正反面问题。

首先,PVDF膜本身是不区分正反面的,两面都可以用。但是转膜之后就分为与胶直接接触的一面和不直接接触的一面。有一种说法认为转膜后,蛋白存在于与胶直接接触的一面,因此,加ECL时要加在与胶直接接触的那面上。

 

另一种说法则认为,转膜后蛋白并不是简单的粘在膜上,而是嵌入膜中了,所以膜的两面都有蛋白,ECL随便加在哪一边。个人同意第二种说话,但是由于转膜的程度不同,两面所含的蛋白量也可能不同。

 

在做Western Blot时,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

 

高能


Western Blot,小编就跟大家分享到这~觉得文章有用的话记得分享给自己的小伙伴们哦~

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