Western Blot试验

• Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎。
  
  一、配胶
  
  这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外)，过滤后作为储存液避光存放于4 ℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡(否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟)，加入10%AP(0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100)及TEMED(分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000)

PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵(AP)一定要新鲜——最好用小指管配AP(写日期)保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，

灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度<10%时可用0.1%的SDS封，浓度>10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。

如用醇封胶需用大量清水及ddH₂O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴

10%的AP最好现配现用，如在4 ℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉

过硫酸铵(APS)(10%;w/v)

取3 g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30 mL。此溶液4 ℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制

但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。

二、样品处理

先制备蛋白样品，后灌注压缩胶，压缩胶灌注后应在20~40 min内使用。

上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer(别小气，重复使用会降低缓冲能力的)，好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。

电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物

溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.

样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：

1. 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

2. 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。

3. 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。

4. 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(建议加入合适的蛋白酶抑制剂) 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80 ℃中保存，但要注意不要反复冻融。

三、电泳

所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积

低电压短时间的预电泳(恒压10-20 V,20-30min)，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通

以初始电压为45 V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳

注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液

凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，

四、转膜

由于转膜过程中的气泡问题对于实验结果有很大的影响

切记：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许气泡存在。

将PVDF膜先在甲醇中浸泡几分钟,再转移到转膜缓冲液中处理15min。

PVDF膜，125-200 ug/cm²(适合于SDS存在下与蛋白质的结合)

另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%(据说0.05%效果最好)

PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理(不超过15秒)再用缓冲液平衡，才能用

如果WB前没有可参考的资料——比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件(稀释度)，可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂;

切个小角是常用的方法。膜上要做好标记，识别正反面和上下

膜彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的

半干电转移要防止过热

转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好

切记。封闭时间和封闭剂的量都要足够。封闭不完全，后面就全白忙活了

五、封闭及杂交

可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。

一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的WB稀释度附近做2—3个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些

反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4 ℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。

封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200 ml PBST或 TTBS加入10 g脱脂奶粉即为封闭液。

一抗溶液中加入0.2% 叠氮钠后可4 ℃存放至少2周(一个月我也用过，没问题，再长时间还没试

六、发光鉴定

一般的WB检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分

化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素;而后者由于直接显色而操作简便且成本低。最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP(Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类)和碱性磷酸酶AP(Alkaline Phosphatase)

最熟悉的底物应该是二氨基联苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。DAB的选择有一点小小的技巧——二氨基联苯胺4盐酸盐的纯品分子量为360.1，通常是深棕色粉末，不太好溶于水，容易得到有色颗粒的溶液而导致膜上的背景，而且价格还被炒得贵;但是如果选择2水合二氨基联苯胺4盐酸盐(分子量396.14)就是白色粉末状晶体，易溶，溶液无色均匀，量大价格还便宜。

HRP化学发光反应底物，化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光，不同于生色反应般形成不溶的产物于膜上累积，所以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检测。

分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10 mmo lEDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。

所以选择正确的蛋白Marker也是Wb实验成功的必要条件之一。

在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。

多次反复冻融对于蛋白的危险，不用多说吧。

这种预染蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率

真的有这样一种产品，抽掉了WB中费时的非必需步骤——转膜和封闭，直接在PAGE电泳胶上做免疫印迹!这个几乎颠覆传统WesternBlot概念的技术创新，完美演绎了“没有做不到，只有想不到”这一句话。

注意事项：

1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关.因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次剃度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如,透析.

2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度.因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合.

3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内.

4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的旗袍和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20 V,20-30min)

5. 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象

6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液

7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数,,但是反复冻融会使蛋白质降解

8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印.

9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔

10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系.

11. 转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC膜对应正极

Western Blot原理宝典

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

1. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决?

解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5-10%甲醇

2. 有什么方法可以提高上样量?

解答：可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量。

3. 一抗，二抗的比例是否重要?

解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底

4. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的?

解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的

影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：

1. 电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。

2. 胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。

3. 一般电泳是积层胶60-80 v，分离胶100 v

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