【十年西部长城会】张源明:活化的T细胞核因子信号通道在新疆哈萨克族高血压患者中的表达

        低级别炎症是高血压的关键致病因素，他可以诱导血管功能改变，使血管微环境发生改变，从而激活T细胞和单核细胞，共同分泌炎症因子,使活性氧(ROS)产生增加，进而导致内皮依赖的血管舒张功能减少,从而促进血管收缩。其中，炎症因子肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor α， TNF-α）可以增强局部炎症反应，促进血管重塑，并能刺激血管内皮细胞产生氧自由基，从而使氧化脂质代谢产物增多，造成细胞内膜损伤 。不仅如此，还有学者指出T淋巴细胞，包括T辅助细胞（Helper T lymphocytes  Th）如Th1、Th2、Th17，抑制性T细胞（包括调节性T细胞）表达的转录因子Foxp3和AngⅡ的生成 密切相关，进而参与高血压的发生发展，而钙调磷酸酶/活化的T细胞核因子（calcineurin/nuclear factor of activated T cells ， CaN/NFAT）信号通路可以对 Foxp3+的适应性调节性T细胞（adaptive Regulatory T cell ，aTreg）的发育、分化有重要的影响，诱导或抑制相关基因的表达，还可以和钾通道共同参与淋巴细胞激活,而本课题组前期试验已证明哈萨克族高血压患者淋巴细胞上含有更多功能的钾通道，并且包括电压依赖钾通道（Kv1.3）和钙激活的钾通道（Kca3.1）在内的钾通道电流水平均上调，但CaN/NFAT信号通道在外周血T淋巴细胞中的基因表达情况仍不明确，鉴于此，本文将运用实时聚合酶联反应（quantitave reverse transcription polymerase chainreaction,q-PCR）和蛋白印迹（western-blot，WB）技术观察两组哈萨克族人群患者外周血T淋巴细胞中NFAT和TNF-α的表达情况，以明确NFAT信号通道在淋巴细胞中的表达，并简单阐述它在淋巴细胞激活中的作用，为T淋巴细胞参与原发性高血压（essential hypertension,EH）炎症反应提供实验依据。

　　1.研究对象：采用随机数字表的方法读取40个数字，其中高血压组男女各10个数字，正常对照组男女各10个数字，以数字号码代表就诊序号，选取2014年7月至2014年11月就诊于新疆医科大学第一附属医院高血压科的哈萨克族高血压患者，且未经任何抗压及抗炎治疗其中男女各20例，平均年龄54.20±9.13，平均血压 (169±11)／(104±7)mm Hg(1 mm Hg=0．133 kPa)。选取同期、同民族的健康体检患者，男女各10例，平均年龄54.25±8.71，平均血压 (113±11)／(78±6mmHg)所有受试对象均严格按照以下纳入排除标准执行。

　　诊断标准为2010中国高血压防治指南的高血压诊断标准：收缩压≥140mmHg和（或）舒张压≥90mmHg。排除标准为：经实验室和临床检查诊断为继发性高血压、动脉粥样硬化、急性脑血管病、风湿性心脏病、先天性心脏病、急慢性感染、全身免疫系统性疾病、糖尿病、重要脏器功能衰竭等疾病之一的患者。

　　本研究所有操作程序均获得了新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准。人选对象均签署了知情同意书。

　　2.主要试剂和设备：

　　CRP ELISA试剂盒(eB，美国)，人淋巴细胞分离液(Sigma，美国)。磁力分选器、抗体、磁力架（美天旎，德国）。Trizol（life，美国）， 反转录试剂盒（Thermo Fisher，美国），RT-PCR试剂盒（QIAGEN，德国）,RIPA裂解液（Thermo Fisher，美国），兔抗人单克隆抗体、羊抗兔二抗（Abcam，英国）,BCIP/NBT显色剂（Invitrogen，美国）。BIO-RAD CFX荧光定量PCR扩增仪，水平式电泳仪（北京六一，中国）点转移槽（BIO-RAD,美国）凝胶电泳仪（BIO-RAD,美国）Quanlity图像分析系统。

　　3.研究方法

　　3.1 T淋巴细胞标本的收集：无菌操作采集外周静脉血10 ml，肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，获得的单个核细胞经免疫磁珠阴性分选法分离出T淋巴细胞，分离的T淋巴细胞将分为两份，一份用于mRNA的测定，一份用于蛋白的的测定。

　　3.2 mRNA的提取：分选获得的T淋巴细胞按TRIzol试剂说明书提取总RNA，DEPC处理水溶解RNA。检测总RNA溶液260 nm及280 nm处的吸光度值，计算总RNA浓度和纯度，吸光度比值>1．8可用于后续试验。

　　3.3引物的设计：根据NFATC1 和TNF-α基因在Pubmed中查到的GenBank序列，按照引物设计原则设计引物，由上海生物工程公司合成，见表1。

　　3.4 RT—PCR检测NFATC1 和TNF-α mRNA的表达:将获得的总RNA取1ug进行逆转录获得cDNA，反应条件为42℃1h,72℃5min，。再以cDNA为模板，进行实时荧光定量的检测，反应条件为95℃5min，95℃10s’，60℃30s’,重复 39个循环，再进行溶解曲线的测定。扩增结果采用2-△△CT法分析。

　　3.5 western blot检测外周血T淋巴细胞NFATC1、TNF-α蛋白表达：RIPA裂解T细胞后提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每孔上样量定为30ug，每孔加5ul缓冲液，95℃变性5min后立即放入冰中5min防止其复性,每孔20ul进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，5％脱脂奶粉封闭1h，置于4℃摇床，兔抗人一抗孵育过夜，洗膜后加入AP标记的山羊抗兔二抗37℃摇床孵育1h,再次洗膜后置于显色盒后加入适当BCIP/NBT显色液按说明书进行显色。用Quality图像分析系统进行蛋白灰度分析。

　　4.统计方法：利用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差(x ±s)表示，两组之间比较采用独立样本t检验，检验水准：α=0.05。

　　1.1正常对照组与高血压组之间基线资料：两组年龄、吸烟、  吸烟率、饮酒率、体质量指数、空腹血糖、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等方面比较无统计学意义(P>0.05)，有可比性，见表2  。

　　1.2外周血T淋巴细胞NFATC1 和TNF-α mRNA的表达:RT-PCR结果显示：NFATC1和TNF-α基因高血压组mRNA的拷贝数高于正常对照组[（ 6.08±0.66）比（1.04±0.26）；（11.9±3.01）比（1.12±0.66），P均＜0.05]。见图1（均数±标准差）。

　　1.3外周血T淋巴细胞NFATC1 和TNF-α蛋白表达：western blot结果显示：NFATC1和TNF-α mRNA蛋白表达中，与对照组相比，高血压组蛋白表达明显正常对照组[（0.63±0.02）比（0.19±0.03）；（0.45±0.05）比（0.34±0.06），P均＜0.05]，见图2。

　　20年前，人们首次在活化的T细胞核中提取出活化的T细胞核因子（NFAT），NFAT是可诱导的DNA结合区，可特异性识别IL-2. NFAT家族转录因子有5个亚型，NFAT1(NFATc2),NFAT2(NFATc1), NFAT3(NFATc4)和NFAT4(NFATc3)及NFAT5（NFATL1），可以激活蛋白除NFAT5外，他们均由钙调磷酸酶依赖的Ca2+ 信号调控。NFAT家族不同亚型和不同的转录调节因子作用可以引起不同的效应，比如NFAT1作用于Akt（为57kd的丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，静止时位于胞浆内侧，激活后可离开细胞膜进入细胞核发挥作用）信号通道可以抑制Akt的核定位并阻断乳腺癌细胞的生长和迁徙，NFAT5和粘附分子α6β4整合素相互作用可以刺激NFAT5转录，增加细胞侵袭力。NFAT2组成的四聚体和激活的AP1可以结合核中的DNA，触发T细胞增殖活化。介于以上原因，本文主要针对NFAT2进行讨论。

　　NFAT的N末端和C末端具有两种或两种以上的剪接变异体：中间的核心区域包含一个调节区和一个DNA结合区，这两个区域是相邻的保守区域。调节区又叫NFAT同源区（NFAT homology region ,NHR）。含有包括CaN结合位点calcineurin-binding region，CNBR／calcineurin-binding peptid，CnBP）在内的几个高度保守基序。 CaN广泛地表达于哺乳动物组织中，它由催化亚基CNA和调节亚基CNB以二聚体的形式组成。催化亚基CNA的N端是催化结构域， 其C端的调节域则由钙调蛋白(calmodulin， CaM) 结合位点、 CNB结合位点以及C末端的自抑区组成，此调节区域可以调控NFAT蛋白功能的表达，而CNB亚基还包含了4个结合钙离子的“EF．Hands“基序”。CaN/NFAT信号通路活化过程呈现细胞内钙离子浓度依赖性，不同的胞内钙离子浓度影响CaN的活性状态，最终决定NFAT能否被活化，随细胞内钙浓度的增加，细胞胞质内处于重度磷酸化状态的NFAT脱磷酸化被激活从而进入细胞核启动靶基因的转录。在耦合钙离子动员的情况下，T 细胞表面受体信号介导 CaN/NFAT活化：G 蛋白耦合受体活化磷脂酶C-β（ PLC-β ）和 T 细胞受体复合物（TCR complexity）接受抗原刺激从而启动磷脂酰肌醇信号途径，T 细胞膜表面免疫复合物和受体络氨酸激酶（receptor tyro-sine kinases，RTKs）活化磷脂酶 C-γ（PL C-γ），活化的磷脂酶C将细胞膜上磷脂酰肌醇 4，5 二磷酸[phosphatidylionositol(PI) -4,5-bisphosphate,PIP2］水解为三磷酸肌醇为(IP3)和 二 酰 甘 油(DAG)这两个胞内第二信使 。IP3与内质网上IP3受体结合，从而使内质网上的钙储备释放，引起细胞质内钙浓度的短暂性高峰，胞内尚未阐明的某种信号机制对内质网的钙储备消耗异常敏感，诱使细胞膜上的钙释放激活的钙通道（Ca2+ release-activated Ca2+，CRAC）开放，使得钙离子浓度持续升高，高浓度的钙离子与CaN中的CNB的特异位点结合诱导CNA调节域的构象改变，促进CaM与CNA结合，引起自抑区掩盖CaN的活性位点暴露，从而彻底激活了CaN[13] ．活化的CaN使NFAT的N端调节区NHR多个多个磷酸丝氨酸脱磷酸化，暴露原来被掩盖的核定位信号 (NLS)，增强NFAT与靶DNA亲和力，核转位的NFAT，进入细胞核可单独或与不同核内转录因子(如APl、GATA和FOXP3等)形成协同复合物，诱导靶基因的转录,如 TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6等基因的特异性表达。 

　　本课题组前期试验已证明哈萨克族高血压患者淋巴细胞上含有更多功能的钾通道，并且发现包括电压依赖性钾通道（Kv1.3）和钙激活的钾通道（Kca3.1）在内的钾通道电流水平均上调，而根据本次试验结果我们可以大胆推测上调的钾离子通道的开放使细胞膜两侧的电位梯度加大，形成超极化，促进Ca2+内流，继而触发细胞内下游信号发生一系列的改变，引起钙离子浓度一过性升高，激活CaN，使NFAT脱磷酸化，激活CaN/NFAT信号通路，活化的 CaN/NFAT信号通路参与介导淋巴细胞的增殖以及各种炎性因子的释放，参与高血压的发生发展。

　　本研究以哈萨克族高血压人群为研究对象，仅研究了疾病状态下各指标的表达情况，因此只得出了推测性的结论，继而我们后期的研究方向将通过对动物的体内药物干预和高血压人群的体外干预，进一步证实我们的推测。