靶向肺癌干细胞的海绵抗肿瘤活性化合物的发现

靶向肺癌干细胞的海绵抗肿瘤活性化合物的发现

刘  曼，刘丽云，孙  凡，林厚文

（上海交通大学医学院附属仁济医院药学部，上海200127）

我国肺癌的发病率和病死率位居所有肿瘤前列，且肺癌的治疗困难重重。肺癌干细胞(lungcancer stem cells，LCSCs)是肿瘤耐药、复发及转移的重要原因^[1,2]。最早报道的肺癌干细胞是Kim等^[3]从小鼠支气管肺泡导管连接处分离出一群Sca⁺ CD45^- Pecam ^- CD34⁺的细胞，命名为支气管肺泡干细胞(ronchioalveolar stem cells，BASCs)。研究者对ALDH1和CD44均高表达(ALDHl⁺CD44⁺)的肺癌细胞进行分析，发现该细胞亚群的干细胞特性表型均强于ALDHl⁺ CD44、ALDH1CD44⁺、ALDHl^- CD44及未分选的细胞群，并且ALDHl⁺CD44⁺细胞具有更强的致瘤性，且对化疗抵抗^[4]。将干性基因SSEA1、Nanog、Oct4等导人肿瘤细胞，获得干细胞样肿瘤细胞作为体外药物筛选模型技术已日趋成熟^[5]。Chiou等^[6]在体外共表达Nanog和Oct4于肺腺癌细胞，该细胞表现出明显的干细胞特性，具有较强的体内成瘤能力及诱导细胞发生上皮细胞间质化改变。因此，利用高表达干细胞标志物的肺癌细胞对靶向肺癌干细胞进行药物筛选与研究更有意义。

海绵属于多孔动物门(Porifera)，是最原始的多细胞动物。在其漫长的生存竞争过程中，为了捕食、争夺领地、驱赶捕食者，形成了复杂而强大的化学防御体系，体内产生并积累了大量具有特殊化学结构和生理活性的次生代谢产物，已成为海洋抗肿瘤活性先导化合物的首要来源^[7,8]。在国内外已上市的7个海洋药物分子中，有3种源白海绵：A ra-A、AraC和Halaven^[9]。随着肿瘤干细胞筛选模型的日渐成熟，从海绵中发现新型靶向干细胞的抗肿瘤先导化合物具有重要的临床价值和良好的应用前景。本研究通过构建肺癌干细胞模型，对海绵 A aptos aaptos提取物进行活性筛选，并进一步对活性部位进行分离筛选，最终得到1个具有显著抗肺癌干细胞活性的aapatmine类生物碱。

1.1  材料  海绵 A aptos aaptos二氯甲烷层的8个组分及化合物单体由本课题组提供；；F12K培养基、胎牛血清、谷氨酰胺、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；DM-SO和嘌呤霉素（美国Sigma公司）；CCK8（日本东仁化学公司）；shRNA-Nanog-GFP（上海吉玛制药有限公司）；Poly brene助转剂（美国Snata Cruz公司）；ALD HIA1、CD44、Nanog、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（美国CST公司）。生物安全柜（美国Thermo Fisher公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher公司）；荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）；多功能酶标仪SpectraM axM3（美国Molecular Devices公司）；Odyssey双色红外成像系统（美国LI-COR公司）。

1.2方法

1.2.1  细胞培养  肺癌干细胞培养于含10％胎牛血清和1%谷氨酰胺的F12K培养基(37℃培养箱，5%C0₂)。

1.2.2  慢病毒转染稳定高表达Nanog-GFP于A549细胞系  将生长稳定的A549细胞以1×10⁴/孔铺于6孔板中，使细胞在慢病毒转染时的融合度在50%左右。24 h后，用含6μg /ml poly brene的1 ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液，37℃孵育。4h后加入1 ml新鲜培养基以稀释polybrene。继续培养24 h，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。一般转染48 h后可见明显荧光表达，72 h后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72～96 h进行。24孔板中，每孔加入嘌呤霉素杀死未转染细胞。使用无嘌呤霉素培养基，继续培养，每隔1周需加嘌呤霉素杀死未转染细胞。

1.2.3免疫荧光染色  将合适浓度的细胞悬液接种于10mm培养皿中，培养过夜后加入预热的4%多聚甲醛，室温固定10 min。弃掉固定液，洗涤2次。加入0. 4%   Triton-Xl00通透液，室温孵育15 min。加入1% BSA封闭，湿盒中37℃孵育30min。过夜孵育一抗(Nanog)。洗涤3次，荧光二抗湿盒中避光孵育th。再洗涤3次。加入含DA-PI的封片剂(mounting medium )500μl，静置10 min左右，4℃避光保存，防止荧光淬灭。于暗处用荧光显微镜观察。

1.2.4  Western blot检测Nanog、CD44、ALDHIA1的表达水平  提取各组细胞蛋白，通过BCA法进行蛋白定量，蛋白变性后上样、电泳，待溴酚蓝接近胶底部时停止、转膜，室温用5%脱脂奶粉封闭2h，PBS洗3次，4℃过夜孵育一抗(Nanog、CD44、ALDHIA1、GAPDH)，洗膜，二抗室温摇床上孵育th后，经ECL显色并应用Quantity One软件进行分析。

1.2.5CCK8法检测细胞增殖活力  将5×10³个／孔细胞接种于96孔板中，每孔100μl。细胞培养过夜后加入等比稀释的组分或化合物并设置空白组。每组6个复孔，作用72 h后，弃培养基。每孔加入10μl的CCK8溶液，培养箱内孵育0.5～1 h，用酶标仪测定在450 nm下的吸光度(A)值。细胞存活率(%)一（加药组A值－空白组A值）／（对照组A值空白组A值）×100%。

1.2.6数据处理  所有数据以()表示，使用GraphPad Prism 5.0统计软件进行统计学分析并制作图表。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett's t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1  高表达Nanog-GFP的A549细胞中干性标志物表达增加  通过慢病毒转染稳定高表达Nanog-GFP于A549细胞系，筛选得到稳定表达Nanog的肺癌干细胞系。免疫荧光结果显示，与对照组shRNA相比，shRNA Nanog慢病毒转染组中95%以上的A549细胞带绿色荧光，说明Nanog-GFP已成功转入A549细胞（图1）。Western blot检测发现，与对照组shRNA相比，shRNA Nanog慢病毒转染组中Nanog蛋白水平显著增加，CD44和ALDHIA1蛋白表达水平也相应提高(P<0.05)，提示该类细胞具有肺癌干细胞特征（图2）。

2.2二氯甲烷萃取物分离得到的8个组分抗肺癌干细胞的活性  课题组前期研究发现4 ap to.s  aap tos海绵中活性成分主要集中在低极性的二氯甲烷层，经过减压柱分离得到8个组分D1～D8，不同浓度的组分(1、10、100mg/L)作用于肺癌干细胞48 h后，检测其细胞活力（图3）。组分Dl~D5对肺癌干细胞无明显的抑制作用；组分D6～D8对肺癌干细胞有抑制作用，组分D6的抑制作用最为显著。组分D6在浓度1、10和100 mg/L时，对肺癌干细胞的抑制率分别为(23 .07±1.8)%(P<0.01)、(60 .46±0.9)%(P<0.01和(85 .67±1.2)%(P<0.01)。

2.3 4个aapatmine类生物碱对肺癌干细胞的抑制作用  使用凝胶柱色谱、正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱以及高效液相色谱对组分D6进行分离，得到4个aapatmine类生物碱AP1～AP4，其结构式见图4。用不同浓度的AP1、AP2、AP3和AP4（0 .37、1.11、3.33、10. 00 ;μmol/L）作用肺癌干细胞48 h，检测其绌胞活力。AP-1、AP-3和AP-4对肺癌干细胞均有抑制作用，其中AP-1的作用最明显(图5)。AP-1在浓度为1.11、3.33和10. 00 ;μmol/L时，对肺癌干细胞的抑制率分别为(14. 67±0.3)%(P<0.05)、(42. 13±0.8)%(P<0.01)和(91. 57±2.8)%(P<0.01)。经计算，A P-l作用肺癌干细胞48 h的IC50值是(3.84±0.12)μmol/L（图6）。

越来越多的研究证据表明，肿瘤可能是一种干细胞疾病^[10]。肿瘤细胞在增殖和分化方面与干细胞具有相似之处。自Lapidot首次基于特异细胞表面标志物分离出人急性粒细胞白血病干细胞以来，研究者陆续从胶质瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠癌等临床肿瘤标本中鉴定出了具有特异表面标志物的肿瘤干细胞，为肿瘤干细胞在实体瘤中的存在提供了有力的证据^[11]。

海绵作为海洋药物先导分子最丰富的来源之一，研究者从中分离得到了多种抗肿瘤效果显著的先导分子。但是，目前有关海绵来源具有肿瘤干细胞抑制活性的分子研究报道很少。2011年，Ottinger首次开展了海绵抗肿瘤干细胞活性研究。对采自地中海海域的11种海绵提取物进行了抗前列腺癌和胰腺癌肿瘤干细胞的活性筛选。结果表明，在0.2 mg/ml浓度下，11种海绵提取物均能有效抑制肿瘤干细胞PaCa2和PC3的生长。其中，海绵Crambe crambe的提取物活性最强，在2.0μg/ml浓度下依然具有显著的抑制作用，并对正常成纤维细胞和内皮细胞毒性较小。体内成瘤实验发现，该海绵提取物的抑瘤效果强于吉西他滨，两者联用时，体内肿瘤可被完全清除^[10]。由此可见，从海绵中寻找具有靶向抑制肿瘤干细胞活性的药物先导分子具有较大的潜力和良好前景。本实验成功构建了稳定表达Nanog-GFP的肺癌干细胞A549-Nanog-GFP药物筛选模型，Western blot结果表明，A549Nanog-GFP高表达ALDHIA1和CD44两种干性标记物。利用稳定表达Nanog-GFP的肺癌干细胞模型，对海绵A aptos aaptos二氯甲烷层的8个馏分进行体外抗肺癌干细胞活性评价，发现D6对肺癌干细胞有良好的抑制作用，提示D6中存在抑制肺癌干细胞的活性成分。使用多种色谱分离技术手段对组分D6进行分离，得到4个aaptamlne类生物碱AP1～AP4，对其进行体外抗肺癌干细胞活性评价发现，A P-l对肺癌干细胞增殖具有显著的抑制作用，IC₅₀值为(3.84±0.12)μmol/L。课题组初步认为AP-l具有靶向抑制肺癌干细胞的作用，其具体作用机制还需进一步研究。

综上所述，海绵 A aptos aaptos中分离筛选得到的aaptamine类生物碱AP-l具有靶向抑制肺癌干细胞的活性，这为从海绵中靶向筛选具有特异性抗肺癌干细胞的活性化合物提供了科研思路，进一步帮助研究人员了解海绵抗肿瘤活性的物质基础，丰富靶向肿瘤干细胞的药物分子来源，同时有望获得新型抗肺癌干细胞的先导分子。

【参考文献】略