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做好WB真的并不难吗?

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27

03-2018

做好Western Blot,其实并不难

导读:做了很久的Western Blot,走了很多弯路,不断总结了 WB 实验中可能会遇到的问题,分析可能的原因及对应的解决方案,其实发现 WB 想要做好并不难。

ZFanti

问题 1:转膜不充分

(1) 膜没有完全均匀湿透

使用 100% methanol 浸透膜。

(2) 靶蛋白分子量小于 10000

选择小孔径的膜,缩短转移时间。

(3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值

可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液(pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液。

(4) 甲醇浓度过高

过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。

(5) 转移时间不够

对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。

问题 2:背景高

(1) 膜没有完全均匀湿透

使用 100% methanol 浸透膜。

(2) 洗膜不充分

增加洗液体积和洗涤次数。

(3) 阻断不充分

增加封闭液孵育时间,或者提高温度。选择合适的封闭试剂(脱脂奶粉,BSA,酪蛋白等)。

(3) 二抗浓度过高

降低二抗浓度。

(4) 检测过程中膜干燥

保证充分的反应液,避免出现干膜现象。

(5) 曝光过度

缩短曝光时间。

(6) 抗体与阻断蛋白有交叉反应

检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应。      

问题 3:没有阳性条带

(1)抗体染色不充分

增加抗体浓度,延长孵育时间。

(2)酶失活

直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

(3)标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。

(4)试剂不匹配

一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性。

(5)一抗失效

选择在有效期内抗体;并选择现配现用的工作液。

(6)HRP 抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

问题 4:有阳性条带,但条带比较弱

(1)抗体染色不充分

增加抗体浓度,延长孵育时间。

(2)酶活性降低

直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

(3)标本中靶蛋白含量太低

增加标本上样量。

(4)洗膜过度

缩短洗涤时间。

(5)HRP 抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

(6)抗体活性降低

选择在有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置。

(7)封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间;换用不同封闭剂类型。

(8)曝光时间过短

延长曝光时间。

(9)HRP 抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

问题 5:条带位置(大小)不对;或有非特异性条带

(1)二抗的非特异性结合

增加一个对照:不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗(特异性更强的,只针对重链的)。

(2)一抗的特异性不够

使用单克隆或者亲和纯化的抗体,保证抗体的特异性。

(3)蛋白降解

使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂。

(4)二聚体或多聚体存在

增加蛋白质变性过程及强度。

(5)抗体浓度过高

降低抗体(一抗、二抗)浓度,可以减少非特异性条带。

(6)蛋白上样量过大

降低上样量。

问题 6:背景有斑点

(1)封闭剂中有聚集体

使用前过滤封闭试剂。

(2)HRP 耦联二抗中有聚集体

过滤二抗试剂,去除聚集体。

问题 7:膜上出现反像(暗背景上白色带)

(1)HRP 含量过高

降低酶联二抗的浓度。

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