本文介绍常年Western Blot中各种选择经验。
对于大部分实验室来说，选择抗体是一个比较头疼的问题：Abcam:
品种全，质量较好，价格高，100ul只给你90ul。Sigma：
价格忒贵忒贵的~一只100ul的flag抗体要9000，当然质量有保证，所以说土豪的选择。CST：
性价比最高~你买100ul还送10ul， 缺点是抗体种类太少。Santa: 多克隆抗体棒棒哒，单抗有风险，购买需谨慎。国产抗体：不是贬低国产~而是真心不好用，可以用来做一些免疫组化啥的。我们常常听到一个词叫做“进口分装”，其实不建议购买进口分装的，因为往往只能用一次，第二次用就不好使了。如果你做的蛋白是自己最新发现的抗体，那么很可能还没有市场化的抗体，这个时候就需要自己做抗体了，抗体做的好的效价可达1:10000，当然一般是找公司做的，但是公司良莠不齐，做出来的结果也参差不齐。我们常用的内参一般有actin,
tubulin,gapdh,
在这三个里面，推荐用GAPDH，在cell，nature上面的文章大都是用GAPDH做内参的，因为比较稳定，actin和tubulin有时候可能会出现复带。除非目的蛋白位置和GAPDH在同一位置，一般推荐用GAPDH，当然如果你使用其他的两个内参也非常好就不必换做GAPDH了。一般用到的膜有NC膜和PVDF膜，科研狗推荐用PVDF膜，他的好处是蛋白载量大，韧性好，PVDF膜的蛋白吸附能力很强，长时间电转也不会导致蛋白转过去。唯一美中不足的是用之前需要用甲醇泡之手一分钟，泡完甲醇之后还需要在电转液里面泡几分钟。
NC 膜是国内很多实验室喜欢用的膜，不能用甲醇处理， NC
膜有时候会使结果背景非常高。除了
NC膜和PVDF膜，还有尼龙膜，当然NC膜和尼龙膜常用于核酸杂交。除了类别外，膜还有不同孔径大小的，一般有0.45um和0.22um，根据科研狗的经验来说，20KD以下的蛋白采用0.22um的膜，本科研狗原先做caspase
3（17KD）的时候用过0.45um的膜，不过只用了80V电转了一个小时，但是这样导致上面的条带（50kd以上）的都没转到膜上去，如果你不需要上面的蛋白，可以选择0.45um的电转1h，如果你才用0.22um的，那么可以放心小蛋白也不会被电转出去。一般我们采用的是脱脂奶粉封闭，也有用BSA封闭的，BSA封闭据说是会让非特异性变少，但是对比起来性价比太低，脱脂奶粉封闭效果也不差。奶粉看上去感觉很简单，但是作用很重要，如果选择不好，最终会导致结果漆黑一片，原因在于封闭不好，建议采用进口的脱脂奶粉。一抗我们可以采用室温孵育1-2h或者4度孵育过夜，两种方法各有优势，如果采用4度孵育过夜还想抗体回收利用，建议加入叠氮钠保护抗体，同时注意一抗用PBST/TBST洗膜的时候要洗干净，一般5X5分钟，因为叠氮钠的存在会影响到后面的辣根过氧化物酶的作用。如果你的抗体非常好使，建议室温1h，如果你的抗体结合不太容易，建议采用4度过夜。二抗一般都是室温1h，这个没有太多的选择。目前国内实验室主流存在两种发光体系，一种是化学发光法（ECL），这种方法是灵敏度高，可以检测达pg级别的蛋白量，但是由于是酶促反应，不同曝光时间内得到的信号与样品量不成线性关系，不能做准确定量，这就是如果压片时间长一点，可能没有区别了，压片时间短一些就能看到区别了。另外一种是荧光法，操作简单，荧光信号的强度直接反应目的蛋白的量，可进行较为精确的定量，同时可以在同一张膜上相近位置同时检测两种蛋白。比如两个蛋白一个分子量是53KD，另外一个是58KD，如果用ECL法很难区分，导致我们很可能需要跑重复平行的胶来区别，但是荧光法便可以采用红色荧光和绿色荧光来标记。当然荧光法的灵敏度不如化学发光，并且还需要购买专门的仪器（如odyssey）。如果你们选择的是化学发光法（ECL），在暗室压片的时候，建议事先把X光片裁成比膜稍大，然后同时叠加放置5片X光片，直接压片4h，这样不管底物发光强弱如何，总能选择出一张合适的。相比较来说，可能我们更愿意先压片10min(或其他时间)，然后发光根据强弱来决定第二次压片时间，但是这样往往会错过了最佳的时间。同时注意常常更换显影和定影液，因为最后一步也非常关键，再加上显影和定影液非常便宜。总结：只买最好，不管贵不贵。往往我们采用一些质量不好的抗体或者试剂，导致实验需要推倒重来，综合算下来时间浪费，金钱浪费更加严重来源：科研狗
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