【临床研究】老年人甲状腺状癌组织中斯钙素1表达及其临床意义

甲状腺状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常见的甲状腺恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。1975—2009年间，美国甲状腺癌发病率成倍增加，以微小癌为主^[1]。尽管目前大部分病例诊治得当，但老年患者被诊断为低分化癌的几率更大，预后更差^[2]。斯钙素1 (stanniocalcin1, STC1)来自于斯钙素蛋白家族，这种糖蛋白激素是由斯坦尼小体的分泌，起着调节钙磷平衡的作用^[3]。STC1存在于多种肿瘤细胞中，如乳腺癌、胃癌及肾癌等，并有研究证实其参与肿瘤的发生发展^[4,5,6]。目前，关于STC1在老年人甲状腺良性肿瘤、恶性肿瘤及正常组织中的表达意义及老年和非老年患者PTC表达差异研究报道尚不多见。我们检测了STC1蛋白在不同甲状腺组织中的表达，旨在探讨其表达与PTC临床病理特征的关系，为老年人甲状腺肿瘤的诊断治疗提供更多科学依据。

对象和方法

一、对象

收集2013年1月至2015年3月于本院行甲状腺切除术的老年PTC患者、老年结节性甲状腺肿患者、老年甲状腺正常者和非老年PTC患者术后标本。老年PTC组：64例，女性48例，男性16例；年龄60～75岁，中位年龄65.3岁；有淋巴结转移者33例，无淋巴结转移者31例；TNM分期依据美国癌症联合委员会(AJCC)标准确定^[7]：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期24例；非老年PTC组：60例，女性47例，男性13例；年龄17～59岁，中位年龄39.5岁；有淋巴结转移者40例，无淋巴结转移者20例； TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期12例。老年甲状腺结节组：20例，男性6例，女性14例；年龄60～70岁，中位年龄62.5岁。老年正常甲状腺组：20例，男性5例，女性15例；年龄60～74岁，中位年龄64.5岁。所有纳入研究者均签署了知情同意书，经本院伦理委员会批准。

二、方法

1．实验试剂：

免疫组化及蛋白免疫印迹(Western blot)所用STC1为美国NOVUS兔抗人单克隆抗体(NBP1-59310)，二抗所用试剂为北京中杉金桥生物技术有限公司的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG。双辛丁酸法(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和增强化学发光法(ECL)显色试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。

2．免疫组化：

所有标本均经常规石蜡包埋，每份病理标本切成4 μm厚的切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，乙二胺四乙酸(EDTA)高温高压修复抗原，3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染。所有实验步骤严格按照En Vision试剂盒说明书进行。STC1抗体稀释浓度为1：1 000，用已知阳性切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。结果判定由2位病理科专家在不知临床病例资料的前提下对阳性细胞所占的比例进行计数。以染色强度和阳性细胞百分率相乘得出的分层指数(stratification index, SI)进行评估。染色强度：没有染色：0分；弱染：1分；中染：2分；强染：3分。染色区域：肿瘤细胞少于25%：1分；25%～50%：2分；51%～75%：3分；大于75%：4分。各因子的表达水平由SI指数决定，SI指数≥4为肿瘤因子阳性表达，SI指数≤3为因子阴性表达。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

3．Western blot检测：

取新鲜标本约100 mg，低温研磨后加裂解液100 μl，冰上充分裂解30 min，离心(4℃，12 000 r/min, 15 min)，吸取上清，通过采用BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白上样到配置好的分离胶和浓缩胶中，电泳完毕后转膜，用含5%脱脂奶粉封闭抗原1 h，加入含STC1兔抗人单克隆抗体(1∶1 000稀释)的洗涤缓冲液(TBST)中室温孵育2 h后4℃过夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入对应二抗，室温孵育1 h洗膜3次，每次5 min加入ECL发光液，用化学发光凝胶成像仪成像。

三、统计学方法

所有数据均采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，所有计数资料采用χ²检验，计量资料用均数±标准差表示，检验水准α＝0.05，P<0.05为差异有统计学意义。