肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率亦居各癌症首位,每年因肺癌死亡的人数超过110万,并且每年新增病例120万,在我国,每年约有30万人死于肺癌,在各类癌症引起的死亡中高居榜首[2],肺癌已成为威胁男性尤其是中老年男性健康的第一杀手,我国有超过3亿的烟民,是世界上吸烟人数最多的国家,而研究已证明吸烟是导致肺癌的主要因素,肺癌的高致死率主要原因是缺乏有效的针对肺癌的早期诊断和治疗手段。肺癌根据组织学类型可分为小细胞肺癌(16.8%)和非小细胞肺癌(80.4%),非小细胞癌又可以根据细胞类型分为三类:鳞状细胞癌、肺腺癌和大细胞肺癌。鳞状细胞癌占肺癌的25%,肺腺癌约占肺癌的40%。
MCPH1(Microcephalin)基因也称为BRIT1(BRCT-repeat inhibitor of hTERT expression),该基因的突变是原发性小头畸形(Primary microcephaly)的主要病因之一,该病是人常染色体隐性遗传病,其主要临床特征为婴儿头围减小伴随一定程度智力发育迟缓。近些年的研究发现MCPH1在维持基因组稳定性中起到重要作用,它能参与到细胞周期调控、DNA损伤应答以及肿瘤发生发展等多种细胞活动中。
本研究用pcDNA3.1(-)/BRIT1真核表达质粒转染人肺腺癌细胞株H1299,探讨BRIT1基因过表达后对肺癌细胞凋亡的影响,为进一步研究BRIT1基因在肺癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 质粒和细胞
真核表达质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1由重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心袁成福博士构建;质粒鉴定由本中心胡仁智硕士鉴定。pcDNA3.1质粒、H1299肺癌细胞均为重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心保存。
1.2 主要试剂及仪器
RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司;转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;质粒提取试剂盒和总RNA提取试剂盒购自美国Omega公司;总蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;ECL发光试剂盒购自美国Thermo Fisher公司;RNA逆转录试剂盒购自日本TOYOBO公司;兔抗人BRIT1多克隆抗体购自美国Abcam公司;兔抗人Bcl-2、兔抗人Bax单抗、HRP标记的羊抗兔IgG购自北京鼎国生物技术公司;AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;流式细胞仪购自美国BD公司。
1.3 细胞培养及转染
H1299细胞培养基为含10%胎牛血清的1640培养液,细胞于37℃,5%CO2孵箱培养;转染前细胞计数,以1×105个/孔接种于6孔板中,当细胞融合率达80%时,用Lipofectamine 2000脂质体分别转染质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1和空载体pcDNA3. 1(-)(阴性对照组),另设一孔不转染(未处理组),转染质粒与脂质体的量按照脂质体说明书加量:每个孔4μg质粒DNA、10μl Lipofectamine2000。另设一组pEGFP载体质粒转染组,继续培养48 h 后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,用以检测Lipofectamine 2000脂质体转染效率。
1.4 细胞中BRIT1 基因mRNA表达量的检测
目的基因MCPH1(NM_024596)及内参基因GAPDH(NM_002046)上下游引物均由上海生工公司设计合成,PCR引物见表1。实时荧光定量PCR检测MCPH1的mRNA的表达量:采用SYBR® GreenⅡ法。质粒转染48h后,提取各组细胞总RNA,逆转录合成cDNA,用以上引物进Real-time PCR反应。Real-time PCR反应条件为:95℃预变性10s;95℃ 5s,58℃ 15s,72℃ 15s,共39个循环;72℃ 5s,95℃ 5s。试验重复3次。采用2-△△Ct 法对结果Ct值进行分析。
表1 Real-time PCR中所用引物序列
基因 引物序列 扩增片段大小
MCPH1 正义链:5′-CACCATCTTTCACTCACCTC-3′ 240 bp
反义链:5′-CTTTACTGAGGAACTCCTGG-3′
GAPDH 正义链:5′-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3′ 227 bp
反义链:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′
1.5 细胞中BRIT1蛋白及相关凋亡蛋白表达水平的检测
质粒转染细胞72h后,收集各组细胞,提取总蛋白,用BCA法测定蛋白浓度,煮沸变性后待用。每组取30μg蛋白样品,经SDS-PAGE分离后,电转移至PVDF膜上,根据不同目的蛋白的分子量将相应位置的PVDF膜剪下;5%脱脂奶粉室温振荡封闭2h;不用目的蛋白的PVDF膜用相应的抗体孵育,兔抗人BRIT1多抗(1∶300稀释),兔抗人Bcl-2和兔抗人Bax单抗(1∶500稀释) 4℃孵育过夜;PBST洗膜3次,每次10min;加入辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG二抗(1∶5000稀释),室温孵育2h;PBST洗膜3次,每次10min,用ECL化学发光法检测BRIT1蛋白的表达。以β-actin作为内参蛋白。试验重复3次。
1.6 细胞凋亡的检测
采用流式细胞术。转染后48h,用不含EDTA的胰酶消化各组细胞,1000转, 5min离心收集细胞,PBS洗涤2次,按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作步骤,流式细胞仪检测细胞凋亡。
1. 7 统计学分析
应用SPSS18 统计学软件进行统计分析,实验数据以x±s表示,多组间参数比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Lipofectamine 2000脂质体转染pEGFP质粒的效率
荧光显微镜观察显示,pEGFP绿色荧光质粒的转染效率为70%~80%,见图1。
下:白光下成像 上:荧光下成像
图1 荧光显微镜观察pEGFP质粒转染H1299 48h后的转染效率(×100)
2.2 各组细胞中BRIT1 基因mRNA 的表达水平
PCR结果显示,转染后48h,pcDNA3.1(-)/MCPH1 质粒转染组细胞中MCPH1 基因的2-△△Ct 值较阴性对照组和未处理组明显升高,且差异有统计学意义(P = 0. 00);阴性对照组与未处理组比较,差异无统计学意义(P=0.892)。
表2 实时荧光定量PCR 检测各组细胞中BRIT1基因mRNA的表达水平(x±s,n= 3)
组别 MCPH1(Ct) GAPDH(Ct) 2-△△Ct
H1299
pcDNA3. 1(-)/MCPH1质粒转染组 17.74±0.26 14.34±0.23 61.48±10.72 pcDNA3. 1(-)质粒转染组 23.46±0.20 14.33±0.22 1.15±0.16
未处理组 23.92±0.56 14.60±0.14 1.05±0.36
A: Real-time PCR扩增曲线 B: Real-time PCR熔融峰
NC:未处理组 K:pcDNA3. 1(-)质粒转染组 M:pcDNA3. 1(-)/MCPH1质粒转染组
图2 qRT-PCR检测转染后H1299细胞中MCPH1基因的mRNA表达水平
2. 3 各组细胞中BRIT1 蛋白的表达水平
转染72h后,Western blot结果显示,pcDNA3. 1(-)/BRIT1 质粒转染组(8. 16±0. 41)与阴性对照组(3. 95±0. 37)和未处理组(3. 72 ± 0. 27)比较,HeLa 细胞中BRIT1 蛋白的表达水平明显上调,且差异有统计学意义:
NC:未处理组 K:pcDNA3.1(-)质粒转染组 M:pcDNA3.1(-)/MCPH1质粒转染组
图 3 Western blot检测转染后H1299细胞中MCPH1基因的蛋白表达水平
2. 5 各组细胞的凋亡情况
转染质粒72小时后,流式细胞术显示,pcDNA3. 1(-)/BRIT1 质粒转染组A549细胞凋亡率[(12. 37 ± 0. 19)%]较阴性对照组[(1. 81±0. 22)%]和未处理组[(2. 06 ±0. 10)%]明显升高,且差异有统计学意义(P = 0. 001);pcDNA3. 1(-)/BRIT1 质粒转染组H1299细胞凋亡率[(12. 37 ± 0. 19)%]较阴性对照组[(1. 81±0. 22)%]和未处理组[(2. 06 ±0. 10)%]明显升高,且差异有统计学意义(P = 0. 001),
NC:未处理组 K:pcDNA3. 1(-)质粒转染组 M:pcDNA3. 1(-)/MCPH1质粒转染组
图4 流式细胞术检测转染H1299细胞后各组细胞凋亡情况
3 讨论
从发现MCPH1至今,人们对它的认识已从单纯的抑制端粒逆转录酶活性[11]扩展到能参与多种细胞功能调节、维持染色体基因组稳定的重要细胞因子。在DNA损伤的情况下,BRIT1可以通过协调DNA损伤应答通路中的ATR和ATM通路来应对多种损伤修复和监视细胞周期,从而维持基因组的稳定性。MCPH1可通过调控BRCA1和CHK1来影响DNA损伤诱导的细胞周期检验点,在缺少MCPH1的情况下,BRCA1和CHK1的表达会明显减少,NBS1不能够被磷酸化,从而导致S期和G2/M期的细胞周期检查点丢失。在敲出MCPH1的小鼠表现了基因组的不稳定性,而且敲出后更加容易被诱导出乳腺肿瘤[14]。这些都表明MCPH1与DNA损伤反应有关,因此我们可以假设,在致癌因素存在的条件下,MCPH1的缺失或者低表达能促进肿瘤的发生发展。人类中,MCPH1 基因定位于8p23.1,该区域在许多类型的肿瘤(如乳腺癌、卵巢癌)都常常出现杂合性的缺失(loss of heterozigosity LOH))。最近在多种人类肿瘤中都发现了MCPH1的表达下调,例如乳腺癌、卵巢癌、口腔癌和慢性粒细胞白血病。因此,在人类肿瘤中BRIT1的异常表达表明MCPH1可能是一个新的肿瘤抑制基因。
本课题组前期实验检测了大量临床肺癌和肺正常组织标本后发现,较正常肺组织,MCPH1在肺癌标本中表达有明显下调。这都提示MCPH1在肺癌组织的表达下降可能增加肺癌细胞基因组的不稳定性,导致细胞分裂时周期检查点丢失,从而引起肿瘤组织的凋亡减少,分裂加快,造成细胞增殖与凋亡失去平衡,造成癌细胞增殖失控,故可以推断MCPH1在肺癌发生发展中起重要作用。本实验将真核表达质粒pcDNA3. 1(-)/MCPH1转染H1299细胞后,细胞中MCPH1基因在mRNA和蛋白水平上的表达都明显上调,并且诱导了两种细胞系的细胞凋亡,但是MCPH1究竟通过哪种凋亡途径来诱导细胞凋亡及在凋亡途径中具体所扮演的角色需要进一步研究。本实验为进一步研究MCPH1基因在肺癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础,对其功能的进一步研究可能为肺癌的早期诊断和后期的特异性治疗提供新的思路,通过基因治疗恢复MCPH1的功能,或通过其它方法上调包含MCPH1的通路可能会阻止这些突变个体的癌症发展,也可以在肿瘤中使用MCPH1诘抗剂可能使得这些肿瘤对基因治疗更加敏感。
作者:张冀
策划:田华
审稿:张腊
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