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实验宝典|Western bolt蛋白质印迹法

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楼主

       一位做了5年western blot的网友总结到:实验上根本省不下来钱,一个环节的烂货就会导致全盘失败。对于实验设计而言,也是如此,一个步骤的bug会导致整个实验立题和评估的逻辑混乱。如果要追求性价比,也就是如何发挥穷人的劳斯莱斯的最大收益,那从一开始就要按秋后算账的原则选择试剂,要算总账;如果要让实验顺顺利利,那就得注意每一个环节,步步为营,细节决定成败。

       课本上可以翻到的东西我们不再详谈,下面小编为大家整理这位WB大师的经验:

1

抗体选择

        对于国内的大多数实验室来讲,做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单,买进口抗体捉襟见肘,买国产抗体得需要大无畏的勇气,在这五年的western blot实验历程里,我先后用过进口抗体,进口抗体国内分装包装,国产抗体,质量良莠不齐。


进口抗体一般不会出现闪失:abcam品种全,质量过硬,但价高(3400元/100微升),而且说是100微升,但至多能吸出来90微升;Sigma的价最贵;比较有性价比的是CST的抗体,现在好像是2200元/100微升,我前后用过二十几种, 1:1000的稀释比下,还没有失过手,100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验,还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升,唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以,但是选用Santa的单抗还是有风险,估计这也是业界共识了吧。  

进口抗体国内分装包装我也用过不少(420元/100微升),大概好抗体的比例约为50%,如果能做出来,也存在一个问题,就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对(抗体品种,货号等完全一致),在都能做出来的前提下,原装抗体能重复使用的次数要多出许多。  

国产抗体比较知名的就几家,但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多,而且杂带多,背景不干净。

2

实验条件选择

Western Blot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的,按以下的网址下载下来就可以了(http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf)。具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货,配出来的胶可以提在手里玩,弹性非常好,价格比sigma的便宜许多,1公斤好像是480多人民币,够实验室用好长时间,现在我们实验室做双向电泳都用biomol的胶,很好用。Marker我现在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了,兰州的代理是上海生工。  

要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用,具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。  转膜我通常是快转两百200毫安/2小时,慢转80毫安/12小时。快转是一定得做冰水浴,就是把槽子泡在冰水混合液里。  

封闭我通常用BD的脱脂奶粉,不归,260元500克,也是从北京华美买的。  

ECL我用pierce的,500毫升1650元,比国产的还便宜好用。  

胶片是柯达的,以前用过乐凯的,不如柯达。


3
设备选择

目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad(伯乐),尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶,但通常用不上,由此造成垂直缓冲液的浪费,而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽,容易漏液,塑料夹应该是有疲劳寿命的,估计日子一长,弹性就会改变。  

Biorad的一套系统得两万多,上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样,而且可以通用,不带电泳仪 是5千多一套,挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐,胶架容易断裂。不过仔细算算,三套天能也就是一套伯乐的价格,值了。

北京六一的垂直槽很转移槽很好用,但垂直槽配胶不方便,玻板太厚,散热不好,但能用,六一的电泳仪(电源)还是很好用的。



4
实验关键

Western Blot操作步骤多,每一步的失误都会造成全盘失败,综合而言,抗体仍然是决定成败的关键,如果抗体很滥,就是神仙也没招。其中内参抗体很重要,因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。Actin,Tubulin,GAPDH我都用过,Actin,Tubulin的缺点是有时候会出现复带,比较稳定的还是GAPDH。如果用心看看cell,nature,science上的文章,大多用GAPDH做内参。进口的,国内分装的,国产的,我都用过。进口的最强的1:10000都能做出条带(Upstate,现在被Minipore招安了),国内分装的也好用,但就是不好回收重复使用,国产的一般只能用一次。我要特别强调的是,实验室里最贵的抗体实际上是内参抗体,因为只要Western Blot开工,每次都得用内参抗体,而一般目的蛋白的抗体也就用几次,重复三次就了事。但内参抗体是不折不扣的耗材,严格意义上将,每跑一次胶,就得杂一次内参,使用频率最高决定了内参是最花钱的抗体。我也自己制备过内参抗体,但好像因为种属同源性太高,背景总是不干净。进口的好,太贵;国产的只能使用一次,年终算账,不比进口的便宜。

我自己的体会是多抗制备并不是技术含量极高的事,为什么国内企业高的早不了,低的造不好呢?现在我用的是杭州贤至的GAPDH兔多抗,200微升420元钱,我在蛋白上样量12微升/孔的情况下,按1:2000稀释比,条带非常清晰,没有杂带,是我目前用过的最好的国产抗体,我估计按1:4000照样能做出来,因为按按1:2000稀释做,在暗室里点上ECL后肉眼清楚地看到荧光条带。抗体我在不加叠氮化钠的情况下4度过夜杂交,可回收重复使用5到6次。最早我是2008年在丁香通上看到了杭州贤至(当时名叫杭州松华)发布的广告,我就怂恿实验室主管买了2支,很好用。











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