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实验新人必读(一):免疫组化(IHC)全攻略(含视频)

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作者:解螺旋·子非鱼

如需转载请注明来源:解螺旋·医生科研助手


导语

开学在即,学生党已哭晕在厕所。对于实验狗而言,开学即意味着实验+日夜颠倒的实验+苦思冥想的实验.....没办法,谁让实验是这个专业进阶的武器,大学里刷实验那是必备技能。在科研大世界中,实验方法总是层出不穷,而免疫组化(IHC)作为经典中的经典,自然是实验狗必备的技能之一。现在,小鱼就把IHC的全攻略分享给大家。

IHC的“基石”:原理及步骤
师兄们说过,做实验时最基础的就是深刻的铭记原理,如此在实验的实操阶段才能真正做到胸有成竹。简单来说,免疫组化就是一项利用抗原抗体反应来确定组织细胞内抗原和对蛋白定位、定性的实验技术。各位小伙伴们可以通过下面的视频对免疫组化有个大致的了解。
 

免疫组化视频链接:




接下来,重点来了,下面是小鱼多年总结的免疫组化步骤和经验,各位看官千万不要错过哦!


 


免疫组化的标本主要是组织标本和细胞标本两大类。组织标本中包括石蜡切片(标本制作的首选方法)和冰冻切片。一般而言,石蜡切片要求薄厚均匀,切片完整,且无褶无刀痕,相当考验实验人员的刀工,在此小鱼真心建议大家找专业培训过的人员或公司进行切片。当然,你也可以在解螺旋公众号里回复“切片”,下载石蜡切片的炼成方法。



1)脱蜡与水化:将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min,这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化,好让组织切片牢固地贴在玻片上。而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min,乙醇梯度(高至低:100%、95%、80%、70%)各2min,水洗5min(不要直接对着切片冲洗)。PBS洗3次,3 min/次。

2)细胞通透与封闭:用预热的封闭通透液(40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2)浸润切片30min(RT 避光),降低内源性过氧化物酶的活性。PBS洗3次,3 min/次。

3)抗原修复:由于制作石蜡切片时,甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性,这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。

小鱼常用的是微波修复,pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片,在微波炉里高火4min至沸腾后,取出自然冷却至室温,重复2次,每次补足液体以免干片。(当然有的朋友用酶修复法也是可以的)。PBS洗3次,3 min/次。

4)血清封闭:用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈,并对圈内的组织滴加稀释好的血清,37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。

5)孵育一抗:对圈内的组织(面积为1×1)滴加稀释好的一抗20ul,4℃过夜或者37℃ 1-2h。PBS洗3次,3 min/次。(一般4℃过夜后,需要将切片放置37℃复温45min,防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定

6)孵育二抗:对圈内的组织(面积为1×1)滴加稀释好的二抗20ul,37℃ 1-2h,PBS洗3次,3 min/次。


7)切片显色:用DAB-H2O2显色10min,显色液最好是现用现配,此时要通过显微镜观察染色是否明显,10min内即可用蒸馏水终止显色。

8)复染及封片:为了形成细胞轮廓,更好的定位目标蛋白,可用Mayer苏木素染色30s,水洗,盐酸酒精分化2s,流水浸入15min。脱水时,乙醇梯度(由低至高:50%、70%、95%、100%)各2min。二甲苯5min使切片透明化,最后加入中性树胶封片(一般封片后最好立即拍照,若不能及时拍照,可用指甲油封固并保持好避光和湿度)。
 

免疫组化的实验操作指导视频:



实验结果分析
至此,我们才千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子,可是如果不知道如何对片子进行正确地分析,进而得出理想的结果,也实在是一件憾事。为了帮大家分忧解难,在此,小鱼将免疫组化结果分析的独门绝招献上,请大家不要眨眼喽。
 

1)必设对照组。如阴性、阳性及自身对照。




由表中可知,只有6、7实验结果有意义。1-5均因对照组的结果已否定抗体的特异性或因ICH技术操作存在错误等而使实验结果失去意义,则必须重复实验或换用抗体。
 
2)抗原表达必须在特定部位,如LCA应定位于细胞膜上,CK应定位于细胞浆内,PCNA及P53蛋白应定位于细胞核内等等。
 
3)半定量。现在一般用图像分析系统进行定量。但如果你的实验室里不幸没有那么高大上的仪器的话,就只好赶鸭子上架,用肉眼定一下量了。由于人为主观性较强,故称为半定量。
 

免疫组化的半定量一般分为三级:弱(+),中(++),强(+++)。以绿色免疫荧光为例,则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱(+)=1,中(++)=2,强(+++)=3。至少随机观察5-10个HPF。然后根据(+)% x 1 +(++)% x 2 +(+++)% x 3计算出数值;总数值<1.0者为(+),1.0-1.5者为(++),  >1.5者为(+++)。



4)图像分析仪进行精确定量。在此强烈推荐一款图像分析软件:Image J。一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。其界面非常简洁,如下图所示。




举个栗子,我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么,如何用Image J来计数细胞的个数呢?



首先,要把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下:Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后,将要计数的部分用高亮标示出来。步骤如下:

Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标,直到所有的细胞被标示出来。



有时候2个细胞靠得比较紧密,会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。步骤如下:Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示,这些是本来计数成一个的细胞,经过水洗之后,更加精确地被计数成了2个细胞。


然后,就可以正式开始分析了。步骤如下:


Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前,还有一些选项需要选择。如果想要计数全部的细胞,那么Size项里面选择“0-infinity”。Circularity的默认值为“0.00-1.00”。一般就取默认值。



最后的结果如下图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像,所以就是每个细胞的面积。然后计数了一共有72个细胞,总面积为21286.00,平均大小为295.64。



IHC的疑难杂症
但是正如罗马不是一天建成,好的实验结果也不是一蹴而就。在抵达罗马的路上,小伙伴们总是会在经受到各种糟心实验结果的千锤百炼后,才能真正获得漂亮的可以见刊的免疫组化图片。那么在进行免疫组化的实验过程中,到底有哪些静待实验新手跳进去的陷阱呢?
 

一般而言,免疫组化的染色失败时,无非会出现以下4种情况:1)所染的全部切片均为阴性,包括阳性对照在内。2)所有的切片均呈阳性反应。3)所有切片背景过深。4)阳性对照染色良好,检测的阳性标本呈阴性反应。



另外,小鱼也总结出了做免疫组化会产生非特异性染色结果的8个大坑及避免掉坑里的一些做法。
 
1. 抗体问题,别嫌贵,一分价钱一分货!
 
一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色,建议用高纯度,高效价,特异性高的单克隆抗体来解决。单克隆抗体很贵,不过结果真的很好。毕竟一分价钱一分货,使用单克隆抗体做一抗时,背景的非特异性染色不会太深。同时,一抗过期也会造成悲剧,因而要注意抗体的有效期。
 
2. 抗体浓度过高/孵育时间过长
 
当一抗浓度太高时,可通过做预实验来摸索出抗体最理想的工作浓度,不能简单地按照说明书来用。若是抗体孵育时间过长,可在加上抗体后,立刻调好定时器,提醒自己及时终止反应,就会避免这个问题。
 
3. DAB染色时间太长/变质
 
DAB的显色时间不是一成不变的,主要靠实验者在显微镜下盯着,一旦出现浅浅的棕色的时候,就要马上冲洗。出现棕色的时间过短,表明抗体浓度过高;出现棕色的时间过长,表明抗体浓度过低。DAB要保存于避光干燥的地方,现用现配,临用前才加入H2O2。图1就冲洗的有些晚了;图2就是刚刚好,染色效果棒棒哒!

 


4. 内源性酶和生物素
 
一些内源性酶生物素含量丰富的组织,如肝脏,肾脏,脾脏等在做免疫组化时极易产生非特异性染色。此时可将左旋咪唑(24 mg/ml)加入底物液中,并保持PH值在7.6-8.2,即能灭活大部分内源性碱性磷酸酶;而对于酸性磷酸酶,可用50 mmol/l的酒石酸来抑制;对于内源性过氧化物酶,可以用0.9%的双氧水来灭活。对于内源性生物素,染色前将切片浸于25 μg/ml亲和素溶液中15 min,PBS清洗15min后即可染色;也可以用24 mg/ml的卵白素封片15 min。
 
5. 组织变干
 
一下子染太多片子的时候,容易出现这种情况。此时,要谨记贪多嚼不烂,一次少染几张。另外要让试剂充分覆盖组织,超出组织边缘2 mm。然后用PAP笔在组织周围画一个圈圈(圈圈应该距离组织边缘3-4 mm),把修复液圈在里面,可避免修复液流走。

6. 浸泡时间过长
 
切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜,也会引起悲剧。这都是偷懒的做法,但是有时候也是可以偷一下懒的。只要把容器放在4°C冰箱里,过夜那就完全没有问题。
 
7. 清洗不充分
 
清洗一定要充分。PBS液一定要双蒸水新配,用之前再次测PH值。缓冲液用0.05 mol/L的Tris-HCL,0.15 mol/L的NaCl即可。如果加一点去垢剂Tween-20就更好了。
 
8. 封闭血清问题
 
是否选择了正确的封闭血清。原则是选择二抗动物的非免疫血清,例如二抗是羊抗兔,就要选择非免疫羊血清。用PBS稀释为3-10%的溶液孵育切片,37°C 10-30分钟。这里不用洗,直接甩掉即可。当然直接用5%的脱脂奶粉也是可以的,而且效果还是不错的。


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