【大医循证】2018科学文献又一重大发现:姜黄素联合白藜芦醇作用于人体喉癌细胞效果显著!
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摘要: 目的利用姜黄素及其联合白藜芦醇在体外作用于喉癌细胞Hep-2，观察其对人喉癌细胞的影响，并探讨可能的抗肿瘤作用机制。方法采用MTT 法检测各组药物对喉癌细胞增殖的抑制作用; Hoechst 33258 染色法观察各组药物对喉癌细胞核的形态影响; 流式细胞术检测细胞凋亡率;ＲT-PCＲ 检测p65 和aspase-3的基因表达情况; Western blot 法检测各组药物对喉癌细胞p65 蛋白和caspase-3蛋白表达情况的影响。结果MTT 结果显示姜黄素联合白藜芦醇组抑制喉癌细胞增殖的作用要明显高于单独姜黄素组和单独白藜芦醇组( P ＜ 0. 05); Hoechst 33258 染色法的结果显示，经各组药物处理后的细胞核形态与对照组相比呈凋亡特征性改变; 流式细胞术分析结果显示姜黄素联合白藜芦醇组的细胞凋亡率明显高于单独姜黄素组和单独白藜芦醇组( P ＜ 0. 05); ＲT-PCＲ 结果显示姜黄素联合白藜芦醇组的p65 基因表达量与二者单独使用时相比明显降低( P ＜ 0. 05)，而姜黄素联合白藜芦醇组的caspase-3基因表达量与二者单独使用时相比明显升高( P ＜ 0. 05); Westernblot 结果显示与对照组比较，单独姜黄素组和单独白藜芦醇组的p65 蛋白表达明显下调，caspase-3蛋白表达则明显上调，而姜黄素联合白藜芦醇组对p65 和caspase-3表达调控的影响与单独姜黄素组和单独白藜芦醇组相比差异有统计学意义( P ＜ 0. 05)。结论姜黄素联合白藜芦醇在诱导人喉癌细胞Hep-2 的凋亡时具有协同效应，其作用机制可能是通过阻断转录因子NF-κB(p65) 信号通路的活化，上调caspase-3蛋白的表达来实现的。
关键词: 姜黄素; 白藜芦醇; 人喉癌细胞Hep-2;细胞凋亡; NF-κB 信号通路
中图分类号: Ｒ 96 文献标志码: A
头颈部癌是全球范围内发病率排在第六位的恶性肿瘤，对人类健康构成了极大的威胁，其典型的肿瘤类型是处于正常到未分化阶段的不同鳞状细胞癌，喉癌是头颈部的常见恶性肿瘤之一，鳞状细胞癌在喉癌中占比约在90% 以上。WHO 发布的世界癌症报告显示，2012 年全世界喉癌年龄标化发病率为0. 0021%，据估计，每年全世界新增的头颈部鳞状细胞癌患者约为6. 5 万例，死亡率接近50%，目前喉癌的治疗方式主要有手术、放疗以及化疗。有研究显示，对晚期喉癌给以同步诱导化疗可以明显提高喉癌治疗的保喉率［1］。
白藜芦醇( resveratrol) 是一种天然多酚类化合物，主要来源于花生、葡萄等多种植物中，具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤的作用，被认为是新一代的绿色抗肿瘤药物。Cavalieri 的研究指出，雌激素可以通过与DNA 的相互作用来引发癌症，而白藜芦醇可以通过抑制雌激素与DNA 的反应来阻止乳腺癌的发生［2］，还有研究指出，白藜芦醇可以增强喉癌细胞对顺铂的敏感性［3］。
姜黄素( curcumin) 是中药姜黄的一种活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、清除自由基和抗微生物等多种药理活性。近年来，姜黄素抑制肿瘤增殖、促进肿瘤凋亡的作用越来越引起人们的重视，已有研究证实，姜黄素可以显著抑制喉鳞状细胞癌的体外增殖和血管拟态的生成［4］，但姜黄素联合使用白藜芦醇是否可以抑制喉癌细胞的生长尚不明确。本文作者对姜黄素联合使用白藜芦醇是否可以增强二者单独使用时的抗喉癌作用进行初步研究，以期为未来临床应用抗喉癌化疗药物提供理论依据。
1 仪器与材料
全自动酶联免疫分析仪( 美国Awareness公司) ，96 孔培养板( 加拿大JET 公司) ，二氧化碳培养箱( 美国Sheldon 公司) ，离心机( 德国Hermle公司) ，DYY-3 蛋白质电泳仪、DYY-2 稳压稳流电泳仪、DYY-340B 电泳槽、荧光定量PCＲ 仪( 北京六一仪器厂) 。
人喉癌表皮细胞株( Hep-2) ，来源于AmericanType Culture Collection(ATCC，Manassas，VA，USA) ，购自上海复祥生物科技有限公司; 白藜芦醇、姜黄素( 含量质量分数＞ 95%，上海麦克林试剂有限公司) ，ＲT-PCＲ 引物( 生工生物工程( 上海) 公司) ，Trizol、逆转录试剂盒( 美国Thermo 公司) ，标准胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素、磷酸盐缓冲溶液( PBS) 、二甲基亚砜( DMSO) 、PＲMI-1640培养液( 美国Sigma 公司) ，三乙醇胺缓冲盐
溶液( trisbuffered saline，TBS，北京索莱宝公司) ，Annexin V-FITC 流式检测试剂盒( 上海邦奕康生物公司) ，caspase-3、p65、β-action 一抗抗体( 武汉博士德生物科技有限公司) ，Hoechst 33258 试剂盒( 罗氏公司) ，其他试剂( 分析纯，市售) 。
2 方法
2. 1 细胞培养
Hep-2 细胞在含有体积分数10%胎牛血清及青霉素、链霉素的PＲMI-1640培养基中，于37 ℃、
体积分数5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，维持细胞处于对数生长期备用。
2. 2 实验分组
对照组: PＲMI-1640 培养液培养细胞48 h; 姜黄素组: 用含终浓度为40 μmol·L － 1 姜黄素的培养液培养细胞48 h; 白藜芦醇组: 用含终浓度为200 μmol·L － 1 白藜芦醇的培养液培养细胞48 h;姜黄素联合白藜芦醇组: 用含终浓度为40 μmol·L － 1姜黄素和200 μmol·L － 1 白藜芦醇的培养液培养细胞48 h。
2. 3 MTT 法检测细胞存活率
取对数生长期的Hep-2 细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为每毫升5 × 104 个，按每孔
100 μL接种到96 孔培养板中，培养板的边缘孔加入等量无水PBS，设置空白调零孔。将96 孔板置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，24 h后按照实验分组，每孔更换对应培养液100 μL置于培养箱中继续培养48 h，培养结束前4 h 每孔加入5 g·L －1 MTT 溶液10 μL，实验终止时每孔加入DMSO溶液150 μL，震荡10 min。在酶标仪上测定570nm 波长处的吸光度( OD 值) ，细胞存活率=( OD处理组－OD调零孔/OD对照组－OD调零孔) ×100%［5］。
2. 4 Hoechst 33258 荧光染色法观测细胞核形态变化
调整细胞浓度为每毫升2 × 104 个，接种于24 孔板中，每孔1 mL，置37 ℃、体积分数5%CO2
培养箱中培养24 h，按照实验分组处理各组细胞48 h，处理结束后吸出液体，PBS 洗3 遍，每孔加入多聚甲醛溶液1 mL，4 ℃冰箱内固定1 h，PBS洗3 遍，除去残留的固定液，每孔加入Hoechst33258 染色液200 μL，于37 ℃ 水浴避光孵育30 min，荧光显微镜下观察，随机选取六个视野拍照。正常细胞核出现弥漫均匀的低强度荧光，凋亡细胞的细胞核呈浓染致密的固缩形态［6］。
2. 5 流式细胞术检测细胞凋亡率
选取对数生长期的Hep-2 细胞以每毫升3 ×105 个细胞密度接种于6 孔板中，每孔2 mL，按照实验分组处理各组细胞48 h 后，收集细胞制成单细胞悬液，将4 ℃ 预冷的PBS 洗细胞两次后，2 000 r·min － 1离心5 min，重悬细胞于250 μL 结合缓冲液中，调节浓度至每升1 × 109 个细胞，吸取100 μL 的细胞悬液于5 mL 流式管中，加入Annexin V/FITC 5 μL和20 mg·L － 1碘化丙锭溶液10 μL，混匀后于室温避光孵育15 min，在反应管中加入PBS 400 μL，上流式细胞仪分析。结果以散点图表示，横坐标为AnnexinV-FITC 荧光强度，纵坐标为PI 荧光强度，坐标轴左下方FITC( － )PI( － ) 为正常细胞，右下方FITC( + ) PI( － ) 为凋亡细胞，右上方FITC( + ) PI( + ) 为凋亡细胞和坏死细胞，左上方FITC( － ) PI( + ) 为无意义象限［7］。
2. 6 ＲT-PCＲ 法检测p65 和caspase-3 基因表达情况
各组细胞处理结束后，采用Trizol 法提取总ＲNA，取吸光度比值( A260 /A280) 在1. 8 ～ 2.0 内的总ＲNA( 1 μg) 进行实验，并用Prime Script ＲTＲeagent Kit 试剂盒将总ＲNA 反转录为cDNA。取反转录合成的cDNA 在实时定量荧光PCＲ 仪上进行PCＲ 扩增，相关基因引物序列见表1。以GAPDH 为内参基因，反应条件为: 94 ℃ 预变性5 min， 94 ℃，30 s; 52 ℃，30 s; 72 ℃，45 s，共40 个循环，2－△△Ct 法( △△Ct 这是相对荧光定量的一个计算公式的简化形式，用于比较不同样品之间的差别或变化比率) 比较相对表达量，△△Ct = 样
本△Ct － 对照△Ct，实验重复3 次［8］。__
2. 7 Western blot 法检测p65 和caspase-3 蛋白表达情况
各组细胞处理结束后，用冰PBS 缓冲液洗细胞两次，加入预冷的裂解液100 μL 处理细胞，并低温放置20 min。于12 000 r·min － 1、4 ℃ 离心30 min，收集上清液，用BCA 蛋白定量检测法( bicinchoninic acid kitfor protein determination，BCA) 测定上清液中的蛋白浓度。取150 μg 已定量的总蛋白进行体积分数12%SDS-PAGE 实验得到目标蛋白，采用半干转膜法将目标蛋白转移至硝酸纤维素膜上，再用体积分数5% 脱脂奶粉封闭过夜，加入体积比1 ∶ 500稀释的一抗p65、caspase-3、β-action 室温孵育3 h，经TBS 溶液洗涤
4 次后加入体积比1∶ 4000 稀释的二抗，室温孵育1. 5 h，经TBS 溶液再次洗涤4 次后，将硝酸纤维素膜置于凝胶成像系统显影，并记录分析实验数据［9］。
2. 8 统计学分析
采用SPSS 17. 0 软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以珋x ± s 表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 MTT 法检测细胞存活率与对照组相比，姜黄素组、白藜芦醇组和姜黄素联合白藜芦醇组的细胞存活率均明显下降( P ＜ 0. 01) ; 与姜黄素组和白藜芦醇组相比，姜黄素联合白藜芦醇组的细胞存活率明显下降( P ＜0. 05) ; 这提示姜黄素与白藜芦醇联合应用时可以增强二者单独使用时对Hep-2 细胞存活率的抑制效果，结果见表2。
3. 2 Hoechst 33258 荧光染色法观测细胞核形态变化
荧光显微镜下可见对照组的细胞核边缘光滑整齐，呈弥散、暗淡均匀的蓝色荧光; 姜黄素组、白藜芦醇组和姜黄素联合白藜芦醇组的细胞核有明显的核形态变化，如月牙型斑块，并可见DNA 荧光碎片，核染色质浓缩，甚至可见凋亡小体，呈典型的凋亡特征性改变。结果见图1。
3. 3 流式细胞术分析细胞凋亡率
与对照组相比，姜黄素组、白藜芦醇组和姜黄素联合白藜芦醇组的细胞存活率均明显下降(P ＜ 0. 05) ; 与姜黄素组和白藜芦醇组相比，姜黄素联合白藜芦醇组的细胞存活率明显下降( P ＜0. 05) ; 这提示与单独应用姜黄素或白藜芦醇相比，联合应用二者对Hep-2 细胞有更好的诱导凋亡作用。结果见表3 和图2。
3. 4 ＲT-PCＲ 法检测p65 和caspase-3基因表达情况
姜黄素组、白藜芦醇组的p65 基因表达量明显低于对照组( P ＜ 0. 05) ，而姜黄素联合白藜芦醇组的p65 基因表达量与二者单独使用时相比明显降低( P ＜ 0. 05 ) ; 姜黄素组、白藜芦醇组的caspase-3 基因表达量明显高于对照组( P ＜0. 05) ，而姜黄素联合白藜芦醇组的caspase-3 基因表达量与二者单独使用时相比明显升高( P ＜05) 。结果见表4。
3. 5 Westernblot 法检测p65 蛋白和caspase-3蛋白表达情况
按照各分组处理48 h，姜黄素和白芦藜醇对Hep-2 细胞中的p65 蛋白和caspase-3蛋白的表达均有影响，两组单独使用均可减少p65 蛋白的表达( P＜ 0. 05) ，增加caspase-3 蛋白的表达( P ＜0. 05) ，而联合用药组对效应蛋白的影响明显强于单独用药组( P ＜ 0. 05) 。结果见表5 和图3。
4 讨论
a. NF-κB( nuclear factor-κB) 是一种几乎存在于所有细胞的转录因子，广泛参与机体防御反应、组织损伤、应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长等过程。NF-κB 是由p50 和p65 两个亚单位以不同形式组合成的同源或异源二聚体，多种致癌因素可以通过激活NF-κB 途径使细胞发生恶性转化［10］。静止状态下，NF-κB 的p65 亚基在细胞质内与NF-κB 抑制蛋白( inhibitor of NF-κB，I κB) 结合成无活性的复合物，当细胞受到外源信号刺激时，蛋白激酶被激活，IκB 磷酸化并降解，从而释放p65，使其得以进入细胞核中，诱导相关靶基因的转录。
b. 本研究中MTT 和流式细胞术结果显示，同时联合应用姜黄素和白藜芦醇时，对Hep-2 的
体外诱导凋亡效果要优于单独用药组，这提示姜黄素与白藜芦醇二者具有协同作用。细胞凋亡是一种基因严格控制的细胞自主性死亡过程，是细胞外界环境因素与细胞自身综合作用的结果。肿瘤的发生不仅与细胞增殖失控相关，还与细胞凋亡密切相关。目前比较清楚的细胞凋亡信号传导通路主要有3 个: 通过胞外信号激活的死亡受体途径，细胞色素C 释放和caspase( 半胱天冬蛋白酶) 激活的线粒体途经以及内质网途径。线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且在许多生理或病理情况下，可作为凋亡的感受器和放大器，对细胞的存活起重要的调控作用。研究表明，细胞凋亡的线粒体途径是抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的一条核心通路［11］。
c. 本研究中ＲT-PCＲ 和Western blot 的结果显示，与对照组相比，姜黄素组、白藜芦醇组、姜黄素联合白藜芦醇组的p65 蛋白的表达明显下调，而caspase-3 蛋白的表达明显上调，且联合用药组的效果优于单独用药组，这提示姜黄素联合白藜芦醇诱导Hep-2 的凋亡很可能是通过相互间的协同作用来实现的，二者联合使用增强了单独应用时下调NF-κB( p65) 活性的能力，使得其下游与抗凋亡相关的NF-κB 的靶基因( 如Bcl 家族的相关抗凋亡基因) 表达减弱更为明显，从而引起细胞色素C 的释放量较单独用药时有了明显增加，导致细胞色素C /caspase-3 细胞通路的激活得到增强，而高表达的caspase-3 蛋白很可能是引起Hep-2凋亡增加的最直接原因。
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