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【科研必备】Western Blot实验中那些炫彩表象下的本质

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Western blot实验是很常用的一种实验,常用于定量或者定性确定组织或者细胞中蛋白质的表达情况。毛博做Western的时间不长,也算有些心得体会。这里和大家分享一下,更有经典的protcol献上。除了心得体会,还有Western常见问题,以及可能原因分析。都是满满的干货哟。


1.参考文献选一抗


做Western blot实验,一抗非常非常重要。如果一抗选择的不好,神仙也做不出来Western。进口的抗体太贵;国产的抗体不好用。进口抗体一般不会出现问题。市场上知名的几家公司,包括ABCAM,Sigma,CST,Santa Cruz等公司,质量都不错。进口抗体国内分装和国产抗体,质量实在不敢恭维。让人已经无力吐槽。


抗体的选择,毛博有个百试不爽的窍门。那就是——。找一些你的专业方向的经典文献。然后,看文献里面是不是和你的实验用的是同样的组织同样的细胞,看文献里面的Western blot的条带清不清楚,边缘锐利不锐利,最后看文献里面用的是哪个公司的抗体。直接购买即可。


2.Western Blot实验试剂选择


毛博我是按ABCAM公司的经典protocol做的。这里给大家提供一个网址,以供下载(http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf)。


抗体的说明书大家要仔细看。不同的抗体公司推荐的配置的方法是不一样的,比如CST的gamma-H2AX抗体需要用脱脂奶粉配置,而有些公司却要求用BSA配置。


封闭用的奶粉看似简单,其实很重要。如果要凑合,可以到超市买光明牌脱脂奶粉。但是不建议这么做。因为封闭要在室温下过夜的,如果是夏天的话,第二天过来都变成酸奶了。还怎么接着往下做实验呀。其实现在,一般实验用专门封闭的奶粉也不贵。一大罐可以用很久了




3.内参抗体的选择

在Western blot实验中,用的最多的是内参抗体。作为重要的参照系,只要一开始做Western,不管什么蛋白质,肯定要用内参抗体这里,毛博强烈推荐GAPDH。国外大牌杂志上发表的牛论文一般都是用的GAPDH。大牛实验室都用的,肯定错不了。毛博推荐Minipore公司的。因为确实好用。


以上和大家分享了毛博做Western的三点经验体会。下面再谈谈新手在做Western的时候,会遇到的常见问题和可能的原因。


空空如也,转完膜没条带怎么办


新手在做Western的时候,有时候转完膜后,膜上面没有任何条带,白茫茫一片大地真干净!这又是什么原因呢?


这个时候,最大的可能就要考虑是不是膜装反了。不要笑哈。这其实是新手最容易犯的错误。膜反了,直接就没有转上去。如下图所示,要把夹子的黑面对着转移槽的黑面;夹子的白面对着转移槽的红面。




暗夜流星,片子熠熠生辉是好事吗?


新手在做Western的时候,有时候会走向另外一个极端,整张片子都熠熠生辉。像划过暗夜的流星,茫茫大海的灯塔一样。但是,这不是指引你走向成功和胜利哈。而是指引你走向失败和延期毕业。




这种情况,一般是二抗的浓度太高了。导致和一抗结合的二抗太多了,或者加了二抗孵育之后,洗得时间不够长,洗不干净,导致整个膜上面都结合上了二抗。解决办法就是稀释二抗,好好洗白白。二抗稀释多少倍才合适呢?这个要靠摸条件,1:1000,1:2000,1:4000,几个梯度都试一试。


别以为“有背景”都是福!


在中国这个社会,做人有背景有资源有靠山,是一件好事;做Western有背景,可是一件坏事哈。看看下面这个图,黑乎乎的,难看死了。曾经发生过老板将这种膜直接扔下楼,然后让研究生下去捡上来的惨剧。




发生这个情况,一般都是封闭没有封闭完全,或者漂洗没有漂洗干净的问题。封闭的话,5%脱脂牛奶或者BSA 4°C过夜。漂洗的话,室温下至少1小时,用脱色摇床多震荡。


毛博最后再唠叨一句,Western实验是一个需要耐心和细致的实验。每一个步骤都要小心翼翼,注意细节。

(转载自解螺旋微信公众号)


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